第二章-紫外-可见分光光度法在食品检测中的应用.ppt

第二章第二章 紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法在食品检测中的应用在食品检测中的应用一、紫外一、紫外-可见分光光度法简介可见分光光度法简介1、什么是紫外、什么是紫外-可见分光光度法？可见分光光度法？l根据物质分子对波长为根据物质分子对波长为200-760nm这一范这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法定性、定量和结构分析方法2、什么是吸收曲线（吸收光谱）？、什么是吸收曲线（吸收光谱）？l描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而描述物质分子对辐射吸收的程度随波长而变的函数关系曲线变的函数关系曲线l具体做法：具体做法：让不同波长的光通过待测物，让不同波长的光通过待测物，经待测物吸收后，测量其对不同波长光的经待测物吸收后，测量其对不同波长光的吸收程度吸收程度(吸光度吸光度A)，以吸光度，以吸光度A为纵坐标，为纵坐标，辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸辐射波长为横坐标作图，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线收光谱或吸收曲线l吸收光谱的产生吸收光谱的产生：运动的分子外层电子：运动的分子外层电子→吸收外来辐射吸收外来辐射→产生电子能级跃迁产生电子能级跃迁→分子分子吸收谱吸收谱3、吸收曲线对物质定性、定量的基础及方法？、吸收曲线对物质定性、定量的基础及方法？l（（1）定性基础）定性基础：吸收曲线上的：吸收曲线上的λmaxλmax、、λminλmin、、肩峰以及整个吸收光谱的形状，决定于物质的性肩峰以及整个吸收光谱的形状，决定于物质的性质，其特征随物质结构而异，所以它是物质定性质，其特征随物质结构而异，所以它是物质定性的依据。

的依据P171P171））l不同物质为什么会在特定的波长产生吸收峰？不同物质为什么会在特定的波长产生吸收峰？————不同物质的结构不同或者说其不同物质的结构不同或者说其分子能级的能量分子能级的能量(各种能级能量总和各种能级能量总和)或能量间隔各异，因此不同物质将或能量间隔各异，因此不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是辐射，这是UV-Vis定性分析的基础定性分析的基础P164-166:电子跃迁的种类）电子跃迁的种类）（（2）定性分析方法：）定性分析方法： ♥与标准品、标准谱图对比与标准品、标准谱图对比 ♥对比吸收光谱特征数据对比吸收光谱特征数据 ♥对比吸收度的比值对比吸收度的比值（（3）紫外）紫外-可见光谱定性分析的局限？可见光谱定性分析的局限？    有机化合物紫外吸收光谱反映结构中生色团和助有机化合物紫外吸收光谱反映结构中生色团和助色团的特性，不完全反映分子特性色团的特性，不完全反映分子特性：紫外吸收光：紫外吸收光谱只有谱只有2～～3个较宽的吸收峰，具有相同生色团的个较宽的吸收峰，具有相同生色团的不同分子结构，有时在较大分子中不影响生色团不同分子结构，有时在较大分子中不影响生色团的紫外吸收峰，导致不同分子结构产生相同的紫的紫外吸收峰，导致不同分子结构产生相同的紫外吸收光谱外吸收光谱——紫外吸收光谱相同，两种化合物紫外吸收光谱相同，两种化合物有时不一定相同有时不一定相同。

例如：甲苯与乙苯：谱图基本相同例如：甲苯与乙苯：谱图基本相同（（4）紫外光谱用于有机化合物结构辅助解析）紫外光谱用于有机化合物结构辅助解析a.可获得的结构信息可获得的结构信息1））200～～800nm 无吸收峰脂肪族碳氢化合物、胺、醇、无吸收峰脂肪族碳氢化合物、胺、醇、卤代烃等，不含双键或环状共轭体系，且无醛、酮或溴、卤代烃等，不含双键或环状共轭体系，且无醛、酮或溴、碘等基团碘等基团2）） 270～～350 nm有弱吸收峰（有弱吸收峰（ε=10～～100）而无其它强吸）而无其它强吸收峰则说明仅含非共轭的具有收峰则说明仅含非共轭的具有n 电子的生色团发生的电子的生色团发生的n→π* 跃迁（跃迁（R带）带）3）） 250～～300 nm 有中等强度的吸收峰（有中等强度的吸收峰（ε=200～～2000））,芳环的特征吸收（具有精细结构的芳环的特征吸收（具有精细结构的B带）4）） 210～～350 nm有强吸收峰（有强吸收峰（ε≥104），表明含有两个双），表明含有两个双键的共轭体系（键的共轭体系（K）带共轭二烯：）带共轭二烯：K带（带（∼ ∼230 nm）；）；α,β-不饱和醛酮：不饱和醛酮：K带带∼ ∼230 nm，，260nm～～350 nm有强吸有强吸收峰收峰——3～～5个双键的共轭体系。

个双键的共轭体系b.光谱解析注意事项光谱解析注意事项1）确认）确认λmax，并算出，并算出logε，初步估计属于何种吸收，初步估计属于何种吸收带；带；2）观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；）观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；3））pH值的影响值的影响加加NaOH红移红移→酚类化合物，烯醇酚类化合物，烯醇加加HCl蓝移蓝移→苯胺类化合物苯胺类化合物4）识别未知物分子中可能具有的生色团、助色团并估）识别未知物分子中可能具有的生色团、助色团并估计共轭程度计共轭程度(5)(5)定量基础：朗伯定量基础：朗伯- -比尔定律和吸光度加和性比尔定律和吸光度加和性朗伯朗伯- -比尔定律：比尔定律： 当一束光强度为当一束光强度为I I0 0的的单色光单色光通过浓度为通过浓度为c c、、厚度为厚度为L L的的溶液溶液时，溶液对光的吸收度与与溶液时，溶液对光的吸收度与与溶液浓度及液层厚度成正比，公式表示为：浓度及液层厚度成正比，公式表示为：A=KLcA=KLc(6)(6)朗伯朗伯- -比尔定律中需注意的几个问题：比尔定律中需注意的几个问题：lK K称为吸收系数，在单色光波长、浓度、溶称为吸收系数，在单色光波长、浓度、溶剂、温度一定时，剂、温度一定时，K K为常数，为常数，K K常用常用摩尔吸摩尔吸收系数收系数εε表示；表示；l朗伯朗伯- -比尔定律只适用于单色光、溶液，仪比尔定律只适用于单色光、溶液，仪器分光系统和待测液状态都会影响定量准器分光系统和待测液状态都会影响定量准确性；确性；(7)朗伯朗伯-比尔定律的偏离及其原因？比尔定律的偏离及其原因？l根据朗伯根据朗伯-比尔定律，在同一条件下进行测比尔定律，在同一条件下进行测定，定，A-c曲线应为通过原点的直线，但实际曲线应为通过原点的直线，但实际工作中直线常常发生弯曲，这称为朗伯工作中直线常常发生弯曲，这称为朗伯-比比尔定律的偏离。

尔定律的偏离l原因：原因：l吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质吸光物质浓度较高；非单色光引起；介质不均匀引起；吸光物质不稳定引起不均匀引起；吸光物质不稳定引起l摩尔吸收系数摩尔吸收系数εε：：l1mol/L1mol/L浓度的溶液，液层厚度为浓度的溶液，液层厚度为1cm1cm时的吸时的吸收度l强吸收：强吸收：εε＞＞104；；l中等强度吸收：中等强度吸收：102 ＜＜ ε ε ＜＜ 104；；l弱吸收：弱吸收： εε＜＜102；；l摩尔吸收系数不能直接测得？摩尔吸收系数不能直接测得？(8)(8)吸光度加和性：吸光度加和性：l在多组分共存的溶液体系中，体系的总吸在多组分共存的溶液体系中，体系的总吸收度等于各组分吸收度之和，在任意波长收度等于各组分吸收度之和，在任意波长下，共存的多组分中各组分遵守朗伯下，共存的多组分中各组分遵守朗伯- -比尔比尔定律这是多组分定量的基础这是多组分定量的基础lA A总总=A=A1 1+A+A2 2+……+A+……+Ai il = =εε1 1bc+ bc+ εε2 2bc+……+ bc+……+ εεi ibcbc(9)定量分析方法：定量分析方法：a、单组分定量方法、单组分定量方法1）标准曲线法）标准曲线法pက က 先通过全波段扫描，根据吸收曲线特征选先通过全波段扫描，根据吸收曲线特征选择入射波长；择入射波长；pက က 配制该物质不同浓度的标准溶液，测定其配制该物质不同浓度的标准溶液，测定其在入射波长处对应吸光值；在入射波长处对应吸光值；pက က 得到标准曲线后，通过标准曲线法测定待得到标准曲线后，通过标准曲线法测定待测试样的浓度。

测试样的浓度2）标准对比法：）标准对比法：l该法是标准曲线法的简化，即只配制一个该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数出吸收系数k，然后由，然后由Ax=kcx求出求出cxl该法只有在测定浓度范围内遵守该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，定律，且且cx与与cs大致相当时，才可得到准确结果大致相当时，才可得到准确结果b. 多组分定量方法多组分定量方法l由于吸光度具有加和性，因此可以在同一试样中由于吸光度具有加和性，因此可以在同一试样中测定多个组份测定多个组份l设试样中有两组份设试样中有两组份X 和和Y，将其显色后，分别绘，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：例例             1.00×10-3mol·L-1 的的K2Cr2O7 溶液及溶液及1.00×10-4 mol·L-1 的的KMnO4 溶液在溶液在450nm 波长处的吸光度分别为波长处的吸光度分别为0.200 及及0，，而在而在530nm 波长处的吸光度分别为波长处的吸光度分别为0.050 及及0.420。

今测得两者混合溶液在今测得两者混合溶液在450nm 和和530nm 波长处的吸光度为波长处的吸光度为0.380 和和0.710试计算该混合溶液中试计算该混合溶液中K2Cr2O7和和KMnO4 浓浓度吸收池厚度为度吸收池厚度为10.0mm) c.4、紫外、紫外-可见分光光度计的构成、类型和使用可见分光光度计的构成、类型和使用（（1）构成）构成：：光源光源、单色器、、单色器、吸收池吸收池、检测器、、检测器、信号处理器、显示器信号处理器、显示器¡可见光源：可见光源：碘钨灯碘钨灯、钨灯：、钨灯：320-2500nm¡紫外光源：氢灯、紫外光源：氢灯、氘灯氘灯、汞灯：、汞灯：150-400nm¡玻璃吸收池：仅用于可见光区玻璃吸收池：仅用于可见光区¡石英池：可用于紫外光区和可见光区石英池：可用于紫外光区和可见光区标准比色皿标准比色皿短光程微量比色皿短光程微量比色皿通用型微量池通用型微量池专用超微量比色皿专用超微量比色皿微量池架微量池架遮光板遮光板l玻璃吸收池和石英池的辨别？玻璃吸收池和石英池的辨别？l吸收池的配对？吸收池的配对？（（2）紫外可见分光光度计的类型和使用：）紫外可见分光光度计的类型和使用：1））. 单光束分光光度计：单光束分光光度计： 可定量分析；可定量分析； 不能自动扫描吸收曲线。

不能自动扫描吸收曲线752型紫外型紫外-可见分光光度计可见分光光度计a）开机预热b）波长设置c）设置测试模式d）调零e）测样品，读数2). 双光束分光光度计：双光束分光光度计： 减少误差；减少误差； 可进行波长扫描，绘制吸可进行波长扫描，绘制吸收曲线TU-1901紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计 a）接通电源、打开开关，打开）接通电源、打开开关，打开样品室，预热样品室，预热10minb）打开软件）打开软件c）选择测试模式，设置波长）选择测试模式，设置波长d）空白液调零）空白液调零e）测试样品）测试样品3). 双波长分光光度计：双波长分光光度计：l通过切光器使两束不同波长的光交替通过通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差吸收池，测得吸光度差ΔAa）可测多组份试样、混浊试样；）可测多组份试样、混浊试样；b）不需参比液）不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差白溶液等产生的误差)；；c）通过波长的选择方便地校正背景吸收，消除吸收）通过波长的选择方便地校正背景吸收，消除吸收光谱重叠的干扰；光谱重叠的干扰；d）克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。

克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高2950型型4).多通道分光光度计多通道分光光度计ü可光谱扫描、光度测量、可光谱扫描、光度测量、定量测量、时间扫描；定量测量、时间扫描；ü扫描速度快；扫描速度快；光源光源透镜透镜吸收池吸收池光栅光栅光电二极管阵列光电二极管阵列检测器检测器TU-1800SPC 紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计5)新型分光光度计展示新型分光光度计展示光度计光度计PhotoLab Spektral 适于多种形状适于多种形状吸收池吸收池DR2700型便携式分光光度计型便携式分光光度计 便携性便携性5、分光光度法测量条件的选择、分光光度法测量条件的选择（（1）检测波长的选择）检测波长的选择l根据吸收曲线选择根据吸收曲线选择¡不易有其它物质干扰的、较高的和宽的吸收峰处不易有其它物质干扰的、较高的和宽的吸收峰处的波长的波长（（2）溶剂的选择及处理方法）溶剂的选择及处理方法选择原则：选择原则：¡能完全溶解样品；能完全溶解样品；¡在所用的波长范围内有较好的透光性；在所用的波长范围内有较好的透光性；¡纯度为纯度为“光谱纯光谱纯”或经检验其空白符合规定或经检验其空白符合规定。

处理方法：处理方法：¡蒸馏水煮沸去除气泡；蒸馏水煮沸去除气泡；¡乙醇去除醛类、苯等杂质；乙醇去除醛类、苯等杂质；¡环己烷、正己烷去除苯；环己烷、正己烷去除苯；¡氯仿防止光和空气破坏；氯仿防止光和空气破坏；¡乙醚去除过氧化物；乙醚去除过氧化物；¡烃类吸附除杂烃类吸附除杂（（3）参比溶液的选择）参比溶液的选择1））. 溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多干扰少）、显色剂不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；为蒸馏水）为参比；2））. 试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；有吸收时，采用试剂作参比（不加待测物）；3））. 试样参比：如在测定波长处显色剂无吸收而试试样参比：如在测定波长处显色剂无吸收而试样基体有吸收，且试样基体不与显色剂反应时，样基体有吸收，且试样基体不与显色剂反应时，可以试样作参比（不能加显色剂）；可以试样作参比（不能加显色剂）；4））.褪色参比：显色剂和被测试样均有颜色，则在褪色参比：显色剂和被测试样均有颜色，则在一份试液中先加掩蔽剂，再按测定方法加入显色一份试液中先加掩蔽剂，再按测定方法加入显色剂等其它试剂作为参比。

剂等其它试剂作为参比（（4）吸光度读数范围的选择）吸光度读数范围的选择 改变被测液浓度使吸光度在改变被测液浓度使吸光度在0.16～～0.80范围内范围内（（5）显色反应条件的选择）显色反应条件的选择Ø显色剂用量显色剂用量Ø溶液的酸度溶液的酸度Ø温度温度Ø显色时间显色时间Ø干扰组成的去除干扰组成的去除二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 在食品检测中的应用在食品检测中的应用（一）、食品酶分析（一）、食品酶分析l一般步骤：一般步骤：粗酶液制备粗酶液制备→反应反应→终止反应终止反应→ （显色）（显色）→检测检测→计算计算l注意事项：注意事项：¡粗酶液制备时根据目标酶的性质选择缓冲液、温度、粗酶液制备时根据目标酶的性质选择缓冲液、温度、时间等条件；时间等条件；¡酶和底物的反应条件也要恰当；酶和底物的反应条件也要恰当；¡一般以检测产物变化量居多一般以检测产物变化量居多二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 在食品检测中的应用在食品检测中的应用（一）、食品酶分析（一）、食品酶分析1 1、、 - -半乳糖苷酶（乳糖酶）半乳糖苷酶（乳糖酶）以以ONPG（邻硝基苯（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）为半乳吡喃糖苷）为底物测定底物测定 -半乳糖苷酶活力。

半乳糖苷酶活力邻邻- -硝基苯酚（硝基苯酚（ONPONP）：）：黄色，黄色，420nm420nm有特异吸有特异吸收收“不同豆类乳糖酶活力的研究不同豆类乳糖酶活力的研究”l样品处理样品处理：红豆、绿豆、花生、黄豆：红豆、绿豆、花生、黄豆→发芽发芽→取取10g →加加20mL预冷的缓冲液预冷的缓冲液A（（0.1mol/L磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，pH为为7.0、内、内含含5%甘油和甘油和1mmol/L EDTA），冰浴研磨，），冰浴研磨，5000r/min冷冻冷冻离心离心10min，收集上清液待测收集上清液待测l反应反应：：0.2mL 5mmol/L ONPG、、0.2mL pH4.0的的0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液和缓冲液和0.1mL稀释稀释25倍的各种粗酶液，在倍的各种粗酶液，在50℃℃水浴中准确反应水浴中准确反应15min后加后加1.0mL 0.2mol/L碳酸钠溶液终止碳酸钠溶液终止反应l测定测定：紫外分光光度计：紫外分光光度计420nm测反应液的吸光度测反应液的吸光度l计算计算：根据产生的：根据产生的ONP的量计算酶活力酶活力单位定义为：的量计算酶活力酶活力单位定义为：在规定条件下，每分钟在在规定条件下，每分钟在420nm波长下每增加波长下每增加0.001个吸光度个吸光度单位所需的酶量。

单位所需的酶量2 2、蛋白酶活力测定、蛋白酶活力测定l中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶l制备粗酶液时所用缓冲液的制备粗酶液时所用缓冲液的pHpH值不同值不同l常用方法：常用方法：福林福林- -酚法酚法福林福林- -酚法酚法l原理原理: :福林福林- -酚试剂酚试剂( (磷钨酸和磷钼酸混合试磷钨酸和磷钼酸混合试剂剂) )在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应利用蛋蛋白质及其水解产物也呈此反应利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力 l操作过程：即先将酶和底物（酪蛋白）在操作过程：即先将酶和底物（酪蛋白）在一定条件下反应一段时间，然后终止反应，一定条件下反应一段时间，然后终止反应，再取一定量的反应液和福林酚试剂发生显再取一定量的反应液和福林酚试剂发生显色反应，最后用分光光度法检测生成的呈色反应，最后用分光光度法检测生成的呈色物质的量。

色物质的量GB/T23527-2009 ：蛋白酶活性的测定：蛋白酶活性的测定l所需仪器和设备所需仪器和设备 l 分析天平：精度分析天平：精度0.0001g l 恒温水浴：精度恒温水浴：精度±0.2℃℃ l 计时表计时表 l 分光光度计分光光度计 l 沸水浴器沸水浴器 l 振荡混合器振荡混合器 l pH计计: 精度精度0.01pH单位单位 l试剂和溶液试剂和溶液  ¡ 乳酸缓冲液（乳酸缓冲液（pH=3.0pH=3.0）适用于酸性蛋白酶）适用于酸性蛋白酶 ¡磷酸缓冲液的制备（磷酸缓冲液的制备（pH=7.5pH=7.5）适用于中性蛋白酶）适用于中性蛋白酶¡硼酸缓冲液硼酸缓冲液(pH=10.5) (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶适用于碱性蛋白酶 ¡0.4mol/L0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液 ¡0.4mol/L0.4mol/L的三氯醋酸液的三氯醋酸液 ¡10.00mg/ml10.00mg/ml酪素溶液酪素溶液 ¡100μg/ml100μg/ml酪氨酸标准溶液酪氨酸标准溶液¡福林福林- -酚试剂酚试剂 粗酶液制备：粗酶液制备：¡称取经研磨的样品称取经研磨的样品5g，置于，置于100 mL容量瓶中。

容量瓶中测中性蛋白酶则加测中性蛋白酶则加pH7.5的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液50 mL在在25℃℃浸提浸提1h, 测酸性蛋白酶则加测酸性蛋白酶则加pH 3. 0的乳酸的乳酸-乳酸钠缓冲液乳酸钠缓冲液50 mL在在25℃℃浸提浸提1h, 测碱性蛋白测碱性蛋白酶则加酶则加pH10.5的硼砂氢氧化钠缓冲液的硼砂氢氧化钠缓冲液50mL在在25℃℃浸提浸提1h，浸提完成后用相应的缓冲液定容至，浸提完成后用相应的缓冲液定容至100mL，然后取滤液进行酶活力测定然后取滤液进行酶活力测定 标准曲线的绘制标准曲线的绘制        L-酪氨酸标准溶液按下表配制酪氨酸标准溶液按下表配制l分别取上述溶液各分别取上述溶液各1.00ml(1.00ml(须做平行试验须做平行试验) )，各加，各加0.4mol/L0.4mol/L碳酸碳酸钠溶液钠溶液5.00ml5.00ml福林试剂福林试剂使用溶液使用溶液1.00ml,1.00ml,置于置于40+0.2℃40+0.2℃水浴水浴中显色中显色20min,20min,取出用分光光度计于波长取出用分光光度计于波长680nm680nm比色，以不含酪比色，以不含酪氨酸的氨酸的0 0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

归方程 试管号试管号012345100 μ g/ml酪氨酸溶液体积（酪氨酸溶液体积（mL））012345蒸馏水（蒸馏水（mL））1098765酪氨酸实际浓度（酪氨酸实际浓度（ μ g/ml ））01020304050样品测定：样品测定： ¡先将酪素溶液放入（先将酪素溶液放入（40±0.240±0.2））℃℃恒温水浴中，预热恒温水浴中，预热5min 5min ¡取取4 4支试管，各加入支试管，各加入1ml1ml酶液酶液¡ 取一支作为空白管，加取一支作为空白管，加2ml2ml三氯乙酸，其他三氯乙酸，其他3 3管作为测试管各管作为测试管各加入加入1ml1ml酪素，摇匀，酪素，摇匀，40℃40℃保温保温10min 10min ¡ 取出试管，取出试管，3 3支测试管中各加入支测试管中各加入2ml2ml三氯乙酸，空白管中加三氯乙酸，空白管中加1ml1ml酪素  ¡ 静置静置10min10min，过滤沉淀，过滤沉淀 ¡ 各取各取1ml1ml滤液，分别加滤液，分别加0.4mol/L0.4mol/L的的 Na2CO3 5ml Na2CO3 5ml、福林试剂、福林试剂1ml1ml在在40℃40℃显色显色20min20min。

680nm680nm处测处测ODOD值    以空白管调零点以空白管调零点 ¡      注：注：1.3981.398中性蛋白酶制剂和中性蛋白酶制剂和166166中性蛋白酸制剂，除反中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为应与显色温度为30℃±0.2℃30℃±0.2℃外，其他操作同上，标准曲线做外，其他操作同上，标准曲线做同样处理同样处理计算：计算：l酶活力定义为：在酶活力定义为：在40℃40℃，一定，一定pH pH 条件下条件下1 min1 min水水解干酪素产生解干酪素产生1μg 1μg 酪氨酸所需的酶量为一个蛋白酪氨酸所需的酶量为一个蛋白酶活力单位，酶活力单位为酶活力单位，酶活力单位为ug/minug/minl样品酶活力计算：样品酶活力计算：¡X(U/g)=CX(U/g)=C×7×4×V/(10×m)l其中，其中，C C为测定样品时通过吸光度从标准曲线上得来的酪氨为测定样品时通过吸光度从标准曲线上得来的酪氨酸的浓度（酸的浓度（ug/mLug/mL）；）；lV V为制备酶液时定容的体积（为制备酶液时定容的体积（mLmL）；）；lm m为称取样品的质量为称取样品的质量(g)(g)；；l7 7是显色反应时反应体系的体积（是显色反应时反应体系的体积（mLmL）；）；4 4是酶解反应时反是酶解反应时反应体系体积对酶液体积的稀释倍数；应体系体积对酶液体积的稀释倍数；1010是酶解反应的时间是酶解反应的时间（（minmin）。

“紫外光谱法定量测定不同种蛋白酶活力的研究紫外光谱法定量测定不同种蛋白酶活力的研究”l原理原理：利用蛋白酶在一定的温度与：利用蛋白酶在一定的温度与pH pH 值条值条件下件下, , 水解酪素底物水解酪素底物, , 水浴水浴6060℃℃灭酶灭酶, , 然然后加入三氯乙酸使未水解的酪素沉淀除去后加入三氯乙酸使未水解的酪素沉淀除去, , 滤液对紫外光有吸收滤液对紫外光有吸收, , 可采用紫外光谱法可采用紫外光谱法测定根据吸光度计算蛋白酶活力根据吸光度计算蛋白酶活力l试剂试剂：：2%2%酪蛋白溶液；酪蛋白溶液；100 100 μg/ mlμg/ ml标准酪标准酪氨酸溶液；氨酸溶液；0. 4 mol/ L0. 4 mol/ L三氯乙酸溶液；缓三氯乙酸溶液；缓冲溶液冲溶液操作步骤：操作步骤：l粗酶液制备同上法粗酶液制备同上法l测定波长的选择：测定波长的选择：l在在230~ 500 nm 范围内扫描范围内扫描, 得到其吸收光谱曲线得到其吸收光谱曲线操作步骤：操作步骤：l标准曲线的绘制：将标准系列溶液标准曲线的绘制：将标准系列溶液, , 在在275.0 nm 275.0 nm 处处进行测定进行测定, , 并绘制标准曲线。

并绘制标准曲线试管号试管号012345100 μ g/ml酪氨酸溶液体积（酪氨酸溶液体积（mL））012345蒸馏水（蒸馏水（mL））1098765酪氨酸实际浓度（酪氨酸实际浓度（ μ g/ml ））01020304050操作步骤：操作步骤：l样品测定：样品测定：¡先将酪素溶液放入先将酪素溶液放入(40(40±0.2)0.2)℃℃ 恒温水浴中恒温水浴中, , 预预热热5 min5 minl计算：计算：¡X(U/g)=CX(U/g)=C×10×V/(10×m)l其中，其中，C C为测定样品时通过吸光度从标准曲线上得来的为测定样品时通过吸光度从标准曲线上得来的酪氨酸的浓度（酪氨酸的浓度（ug/mLug/mL）（已减去空白）；）（已减去空白）；lV V为制备酶液时定容的体积（为制备酶液时定容的体积（mLmL）；）；lm m为称取样品的质量为称取样品的质量(g)(g)；；l分子上的分子上的1010是滤液定容的体积（是滤液定容的体积（mLmL）l分母上的分母上的1010是反应时间（是反应时间（minmin））两种方法比较两种方法比较3 3、超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶¡原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，原理：在碱性条件下，邻苯三酚会发生自氧化，可根据可根据SOD SOD 抑制邻苯三酚自氧化能力测定抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD SOD 活活力。

力¡试剂：试剂：0.1mol/L Tris-HCl0.1mol/L Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH8.2,pH8.2,含含1mmol/L EDTA-2Na1mmol/L EDTA-2Na））; 4.5 mmol/L ; 4.5 mmol/L 邻苯三酚盐邻苯三酚盐酸溶液酸溶液““青稞苗中超氧化物歧化酶（青稞苗中超氧化物歧化酶（SOD)SOD)活性的测定活性的测定””l样品处理：样品处理：取剪碎的青稞苗样品取剪碎的青稞苗样品10.0 g 置于研置于研钵中，加入钵中，加入100.0 mL 蒸馏水研磨蒸馏水研磨5 分钟，移入分钟，移入离心管用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离离心管用少量蒸馏水冲洗研钵，洗液并入离心管中，加蒸馏水至刻度，经心管中，加蒸馏水至刻度，经4000 r/min 离心离心15min，弃去沉淀，取上清液测定弃去沉淀，取上清液测定l检测：检测：¡在在25 ℃℃左右，于左右，于10 mL 比色管中依次加入比色管中依次加入A 液液2.35 mL，蒸馏水，蒸馏水2.00 mL，，B 液液0.15 mL加入B 液立即混合并倾入比色皿，分别测定在液立即混合并倾入比色皿，分别测定在325 nm 波波长条件下初始时和长条件下初始时和1 min 后吸光度值，二者之差为后吸光度值，二者之差为邻苯三酚自氧化速率邻苯三酚自氧化速率△△A325。

在在25 ℃℃左右，于左右，于10mL比色管中依次加入比色管中依次加入20 uL 样液，样液，A 液液2.35 mL，蒸馏水，蒸馏水2.00 mL，，B液液0.15mL加入B 液立液立即混合并倾入比色皿，分别测定在即混合并倾入比色皿，分别测定在325 nm波长条波长条件下初始时和件下初始时和1 min 后吸光度值，二者之差为样液后吸光度值，二者之差为样液抑制邻苯三酚自氧化速率抑制邻苯三酚自氧化速率△△A ′325l酶活力定义酶活力定义：：25 ℃25 ℃时抑制邻苯三酚自氧化时抑制邻苯三酚自氧化速率速率50%50%所需的所需的SOD SOD 定义为一个活力单位定义为一个活力单位l计算：计算：l[1]李丕武李丕武,刘瑜刘瑜,李瑞瑞李瑞瑞,段梦迪段梦迪,黄少华黄少华. 两种两种葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶酶活力测定方法的比较活力测定方法的比较[J]. 食品工业科技食品工业科技l[2]陈育红陈育红,. 大豆种皮大豆种皮过氧化物酶过氧化物酶活力的测定方法活力的测定方法[J]. 农农产品加工产品加工(学刊学刊),2013,(5).l[3]巫小琴巫小琴,徐强徐强,李燚李燚,陶诗陶诗,黎勇黎勇,. 纤维素酶纤维素酶产生菌的分产生菌的分离及其酶活力测定离及其酶活力测定[J]. 安徽农业科学安徽农业科学,2009,(35).l[4]马歌丽马歌丽,魏泉增魏泉增,张志刚张志刚,. 分光光度法测定大曲分光光度法测定大曲糖化酶糖化酶活力探讨活力探讨[J]. 中国酿造中国酿造,2008,(17).l[5]孙艳波孙艳波,何卫加何卫加,雷虹雷虹,刘跃泉刘跃泉,于景华于景华. 婴儿配方粉中婴儿配方粉中溶溶菌酶菌酶活力的测定及其校正系数的研究活力的测定及其校正系数的研究[J]. 中国乳品工业中国乳品工业,2002,(5).l[6]吴涓吴涓,肖亚中肖亚中,王怡平王怡平,李清彪李清彪. 蜜环菌胞外蜜环菌胞外漆酶漆酶酶活力酶活力的分光光度法测定的分光光度法测定[J]. 厦门大学学报厦门大学学报(自然科学版自然科学版),2001,(4).l[7]禹邦超，邓辉胜，王旭，刘德立禹邦超，邓辉胜，王旭，刘德立. 多种形式多种形式酯酶酯酶总活力总活力的混合底物分光光度测定法的混合底物分光光度测定法[J]. 华中师范大学学报华中师范大学学报(自然自然科学版科学版),1996,(1).l[8]王福荣王福荣,陈敏陈敏. 分光光度法测定分光光度法测定α-淀粉酶淀粉酶活力活力[J]. 酿酒酿酒科技科技,1992,(3).二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 在食品检测中的应用在食品检测中的应用（二）、食品成分分析（二）、食品成分分析1、双波长等吸收点法测定银杏果仁中直链淀粉双波长等吸收点法测定银杏果仁中直链淀粉和支链淀粉含量和支链淀粉含量l原理？原理？l方法：方法：¡样品制备：粉碎、脱脂、溶解淀粉、碘试剂反应样品制备：粉碎、脱脂、溶解淀粉、碘试剂反应¡标准品作吸收曲线，选择波长对标准品作吸收曲线，选择波长对¡标准品系列在选定波长对下测定，作标准品系列在选定波长对下测定，作△△A-c曲线曲线¡在选定波长对下进行样品测定，据在选定波长对下进行样品测定，据△△A计算计算c2 2、食品中甜蜜素的检测、食品中甜蜜素的检测“GB/T 5009.97-2003 “GB/T 5009.97-2003 食品中环己基氨基磺酸钠的测定食品中环己基氨基磺酸钠的测定””第二法第二法 比色法比色法¡原理：原理：分析步骤：分析步骤：l提取：提取：¡液体试样：称取液体试样：称取10.0g试样于透析袋中，加试样于透析袋中，加10mL透析剂，将透析袋口扎紧，放入盛有透析剂，将透析袋口扎紧，放入盛有100mL水的水的200mL广口瓶中，加盖，透析广口瓶中，加盖，透析20h-24h得透析液。

得透析液¡固体试样：称取固体试样：称取2.0g已剪碎的试样于研钵中，加已剪碎的试样于研钵中，加少许海砂研磨至呈干粉状，经漏斗倒入少许海砂研磨至呈干粉状，经漏斗倒入100mL容容量瓶中，加水冲洗研钵，并将洗液一并转移至容量瓶中，加水冲洗研钵，并将洗液一并转移至容量瓶中加水至刻度，不时摇动，量瓶中加水至刻度，不时摇动，1h后过滤，得后过滤，得试样提取液准确吸取试样提取液准确吸取10.0mL试样提取液于透试样提取液于透析纸中，加析纸中，加10mL透析剂，将透析袋口扎紧，放透析剂，将透析袋口扎紧，放入盛有入盛有100mL水的水的200mL广口瓶中，加盖，透广口瓶中，加盖，透析析20h-24h得透析液得透析液l测定：测定：¡取取2支支50mL具塞比色管，分别加入具塞比色管，分别加入10mL透析液和透析液和10mL标准液，于冰浴中加入标准液，于冰浴中加入1mL 10g/L亚硝酸钠亚硝酸钠溶液，溶液，1mL 100g/L硫酸溶液硫酸溶液，摇匀后加入冰水中不时摇动，放置，摇匀后加入冰水中不时摇动，放置1h，取出后加，取出后加15mL三氯甲烷，旋窝混合器上振动三氯甲烷，旋窝混合器上振动1min静静置后吸去上层液。

再加置后吸去上层液再加15mL水，振动水，振动1min，静置后吸去，静置后吸去上层液，加上层液，加10mL 100g/L尿素溶液，尿素溶液，2mL 100g/L盐酸溶盐酸溶液，再振动液，再振动5min，静置后吸去上层液，加，静置后吸去上层液，加15mL水，振动水，振动1min，静置后吸去上层液，，静置后吸去上层液，分别准确吸出分别准确吸出5mL三氯甲烷三氯甲烷于于2支支25mL比色管中另取一支比色管中另取一支25mL比色管加入比色管加入5mL三三氯甲烷作参比管，于各管中加入氯甲烷作参比管，于各管中加入15mL甲醇，甲醇，1mL10g/L磺胺磺胺，置冰水中，置冰水中15min，取出，恢复常温后加入，取出，恢复常温后加入1mL 1g/L盐酸萘乙二胺盐酸萘乙二胺溶液，加甲醇至刻度，在溶液，加甲醇至刻度，在15℃℃～～ 30℃℃下放置下放置20 ～～30min，用，用1cm比色杯于波长比色杯于波长550nm处测吸处测吸光度，测得吸光度光度，测得吸光度A和和Asl另取另取2支支50mL具塞比色管，分别加入具塞比色管，分别加入10mL水和水和10mL透析液，除不加透析液，除不加10g/L亚硝酸钠亚硝酸钠外，其它按以上操作，测得吸光度外，其它按以上操作，测得吸光度As0和和A0。

l计算：计算：二、紫外二、紫外-可见分光光度法可见分光光度法 在食品检测中的应用在食品检测中的应用（三）、食品安全检测（（三）、食品安全检测（P183））很多利用分光光度法检测的是标准中的第很多利用分光光度法检测的是标准中的第二法、第三法；二法、第三法；例如：铅、镉、锌、铜、锡的检测：例如：铅、镉、锌、铜、锡的检测：l原理：显色剂与金属离子形成稳定的原理：显色剂与金属离子形成稳定的显色显色络合物后用分光光度计测定络合物后用分光光度计测定l硝酸盐、亚硝酸盐的检测（第一法）硝酸盐、亚硝酸盐的检测（第一法）l植酸测定：植酸测定：小结小结l紫外紫外-可见分光光度法常用于定量分析，定可见分光光度法常用于定量分析，定性只能作为辅助手段；性只能作为辅助手段；l定量分析时，检测对象若有双键、苯环等定量分析时，检测对象若有双键、苯环等分子结构，则可能有特征紫外吸收，可利分子结构，则可能有特征紫外吸收，可利用紫外分光光度法；否则应通过显色反应用紫外分光光度法；否则应通过显色反应再用可见分光光度法检测；再用可见分光光度法检测；l紫外波长测定时紫外波长测定时要用要用石英比色皿；可见波石英比色皿；可见波长测定时长测定时常用常用玻璃比色皿；玻璃比色皿；l紫外紫外-可见分光光度法定量分析最常用标准可见分光光度法定量分析最常用标准曲线法，需要注意待测液浓度，应使曲线法，需要注意待测液浓度，应使A值在值在范围内（范围内（P174））。