离子交换树脂分离提纯苦豆子生物碱.pdf

北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文1 前 言苦豆子总生物碱中含有苦豆子所包含的绝大多数种类的生物碱苦豆子生物碱为其良好药物活性被广泛用于临床, 不仅具有抗癌、抑癌、抑制和杀灭各种微生物作用 , 而且对免疫系统、神经系统、心血管系统有广泛的药理作用总生物碱的提取方法有多种 , 主要有乙醇提取法、水提取法、酸水提取法及阳离子交换树脂提取法等等目前，国内关于苦豆子生物碱的纯化方法，多用酸水萃取法，用离子交换大孔吸附树脂分离纯化苦豆子生物碱的研究尚未见报道因此，本文着重研究了用离子交换大孔吸附树脂分离纯化苦豆子生物碱的工艺条件，以期找出一种经济有效、 适合大规模工业化生产的分离纯化苦豆子生物碱的方法，旨在为以后进一步研究苦豆子生物碱提供理论依据离子交换法的优点如下： 有机溶剂用量少，离子交换树脂再生后可反复使用；所得生物碱纯度高 缺点是苦参类生物碱与树脂的结合力强，不能将生物碱完全洗出，所以主要生物碱的损失较大[2]利用非极性大孔树脂DF01 直接从苦豆子酸浸取液中离生物碱，生物总碱的吸附量和解吸率分别为17mg/mL 和 96%，分离效果较好，该法的优点是生物碱吸附速度快、解容易、树脂的寿命长[2]。

鉴于此，我们综合离子交换树脂和大孔吸附树脂的优点，采用离子交换大孔吸附树脂来富集分离苦豆子生物碱本实验通过离子交换大孔吸附树脂对苦豆子中的生物碱进行分离，先通过静态吸附与解吸实验选出最佳树脂及最佳吸附时间；然后通过动态吸附实验考察上柱量、上柱流速、上柱液pH 值等因素对吸附率的影响，确定最佳上柱条件；由最佳条件上柱，考察洗脱液、洗脱液乙醇浓度、 洗脱流速等因素对解吸率的影响，找出最佳的解吸条件，从而达到为进一步研究苦豆子生物碱提供借鉴的目的北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文2 第一章、综述1.1 离子交换树脂的发展离子交换树脂是最早出现的功能高分子材料，其历史可追溯到二十世纪30年代1935年英国的 Adams和 Holmes[3]发表了关于酚醛树脂和苯胺甲醛树脂的离子交换性能的工作报告， 开创了离子交换树脂领域， 同时也开创了功能高分子领域离子交换树脂可以使水不经过蒸馏而脱盐，既简便又节约能源 因此根据Adams和 Holmes 的发明，带有磺酸基和氨基的酚醛树脂很快就实现了工业化生产并在水的脱盐中得到了应用1944 年 D'Alelio 合成了具有优良物理和化学性能的磺化苯乙烯-乙烯苯共聚物离子交换树脂及交联聚丙烯酸树脂，奠定了现代离子交换树脂的基础。

此后，Dow 化学公司的Bauman 等人开发了苯乙烯系磺酸型强酸性离子交换树脂并实现了工业化； Rohm也能从其中分离出一种或多种纯氨基酸，供药用或食用自然界中尚存在大量的非蛋白氨基酸，具有药用价值的就有40 余种如美舌藻中的海人草酸、 使君子种子中的使君子氨酸和南瓜子中的南瓜子氨酸均是具有驱蛔虫作用的中草药有效成分它们可用温水、 乙醇或乙酸的水溶液提取， 然后用强酸性阳离子交换树脂如Zerolite 225 进行富集和纯化，得到高纯度的产品[8]牛磺酸在动物体内存在甚广日本专利[9]介绍了一种从牡蛎中提取分离牛磺酸的工艺，即将牡蛎磨碎后以沸水提取，提取液通过Dowex-99、Dowex-88、北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文4 Dowex-66 及 DowexTG-55A 等一组离子交换柱，最终得到纯度≥90%的牛磺酸1.3.2 离子交换树脂法提取纯化抗生素在发酵液中，抗生素的浓度很低，提取时溶剂消耗高，效率低;利用离子交换树脂可以选择性地吸附分离多种离子型抗生素，不仅回收率较高， 而且产品纯度较好关于离子交换树脂对抗生素的吸附性能，苏联学者[10]进行了大量的研究。

抗生素分子中往往含有多种化学基团，在强酸或强碱条件下容易发生化学变化，导致药理活性丧失 因此，提取分离所用的离子交换树脂主要为弱酸性阳离子交换树脂或弱碱性阴离子交换树脂即使偶尔用到强酸或强碱树脂， 通常也先将阳离子交换树脂转化为Na十型或 NH 4+型， 将阴离子交换树脂转化为Cl一型或 SO 42-型离子交换树脂对抗生素离子有较大的选择性，选择系数比无机离子如Na十或 C1一等往往要高出 l~3 个数量级 ;其原因是抗生素离子与离子交换树脂能以多种键型发生吸附作用 除正常的离子静电作用外， 抗生素与树脂骨架间的疏水作用、 杭生素分子中极性基团与树脂上化学基团的氢键或偶极键作用等对提高其选择性起着重要作用 抗生素的分子体积较大， 大孔网状树脂有利于大分子的扩散与吸附，有较大的吸附量因此适于提取分离抗生素1.3.3 离子交换树脂法提取分离生物碱生物碱是许多中草药的重要有效成份它们在中性或酸性条件下以阳离子形式存在，能用阳离子交换树脂从其提取液中富集分离出来钩吻总生物碱具有良好的抗癌作用，其树脂法提取分离工艺所得浸膏总收率为1.07%，纯度 >96%[11]离子交换树脂吸附总生物碱之后，可根据各生物碱组分的碱性差异，采用分步洗脱或分步提取的方法，将其中的各种生物碱组分一一分离。

与溶剂法相比，离子交换树脂法提取分离生物碱具有许多优越之处，不仅操作简便、 消耗低，而且产品纯度好、收率高，更适于工业化生产此外，其它天然碱性化合物(如肌苷)及具有季铵盐结构的天然有机物(如胆碱磷酸甘油酯 )也可用类似工艺提取分离与纯化北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文5 1.3.4 离子交换树脂法提取分离天然酸性有机化合物应用阴离子交换树脂，可从动植物中和微生物发酵液中提取分离天然有机酸乳酸在食品、 医药和有机化工领域具有广泛用途，近年来市场需求量逐年增加以葡萄糖为碳源发酵生产乳酸，从前采用钙盐法分离，生产周期长，产物收率低王子镐[12]研究了强碱性阴离子交换树脂#201x4、D290、D296 及弱碱树脂D370 和 D380 对乳酸的吸附性能后， 发现#201x4阴离子交换树脂 (C1一型)具有较高的吸附量和良好的选择性， 适合于从发酵液中提取分离乳酸另据报道， 郑一舟等[13]以弱碱树脂聚乙烯吡啶提取分离乳酸，因无机离子不产生吸附作用，有利于提高产品质量， 而且吸附在树脂上的乳酸容易用甲醇解吸应用树脂法提取分离工艺生产乳酸，生产周期短，产品回收率高柠檬酸是重要的食品添加剂，从前也用钙盐法从发酵液中分离，消耗大，成本高。

朱珍等[14]使用交联聚丙烯酸甲醋进行多乙烯多胺胺解和甲基化，合成了新型大孔弱碱树脂D280，用于从发酵液中提取分离柠檬酸，结果表明树脂法可提高柠檬酸的回收率A-酮基-L-古龙酸为维生素C 生产的中间体，它由山梨醇经两步发酵制备，过去用浓缩结晶法得到纯品沈金玉等[15]采用阴离子交换树脂法提取分离a-酮基-L-古龙酸，用硫酸 /甲醇解吸，取得了良好的结果 在 D296、 D370、D70l 和 PVP402 树脂中，氨基树脂 D296 和聚乙烯吡啶树脂 PVP402呈现最好的吸附和解吸性能,有希望用于 VC 生产为纯化粘康酸 (已二烯二酸 )，可使发酵液依次通过吸附树脂Diafon HP20 柱和强酸性阳离子交换树脂Diaion SK102 柱先除去杂质， 然后吸附在弱碱性阴离子交换树脂Diaion WA30 柱上，经水洗涤后，以稀氢氧化钠溶液解吸，产物粘康酸的收率为95%，纯度达到 99.6%[16]1.3.5 离子交换树脂法提取分离多肽、蛋白质和酶多肽、蛋白质和酶是由 α-氨基酸缩合而成的生物高分子由于某些氮基酸残基含有羟基或碱基，使这些生物高分子成为两性物质因此，在一定的pH 条件下，离子交换树脂能够提取、分离和纯化多肽、蛋白质和酶。

蛋白质和酶在强酸或强碱条件下不稳定， 强烈的疏水作用也会使其变性，因此所用的树脂应当是亲水的弱酸树脂或弱碱树脂例如，聚丙烯酸系列的弱酸树脂，以纤维素、葡聚北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文6 糖凝胶、琼脂糖凝胶为载体的弱酸或弱碱树脂等均适用于生物高分子的分离与纯化[17]应用这些树脂从动物、植物、微生物及其代谢产物中分离纯化天然多肽、蛋白质和酶的研究报道甚多1.3.6 离子交换树脂法分离纯化核苷酸及核酸核苷酸及脱氧核苷酸为两性化合物， 含有可形成阳离子的碱基和可形成阴离子的磷酸基，因此用阳离子交换树脂和阴离子交换树脂皆可对其进行分离和纯化离子交换树脂法也是分离纯化寡聚核苷酸和核酸的重要技术例如，邱蔚然[18]等用 D293 离子交换树脂成功地从DNA 酶解液中分离纯化出5'-脱氧核苷酸1.3.7 离子交换树脂法分离纯化糖类化合物糖类化合物分子中含有许多醇羟基，只有极弱的酸性， 如葡萄糖的离解常数仅 6.6x10-3，但在中性水溶液中仍能与强碱性阴离子交换树脂(OH一型)发生离子交换作用而被吸附，并易被10% NaCl 水溶液解吸可惜许多糖类物质在强碱性条件下会发生异构化和分解反应，因而限制了OH一型强碱性阴离子交换树脂在糖类物质分离纯化中的应用。

为使糖类物质能用离子交换树脂法分离纯化，人们根据糖中顺式邻二羟基能与硼酸形成复盐阴离子的特性，采用硼酸型阴离子交换树脂或用硼酸溶液作流动相， 从而使搪类物质能在阴离子交换树脂上进行分离纯化钟振声等用此法成功地分离了果糖、半乳糖和葡萄糖[19,20]由于离子交换树脂提取分离技术设备简单，操作方便，生产连续化程度高，而且得到的产品往往纯度高， 成本低，因而离子交换树脂在天然产物提取分离研究与生产中的应用必将日益广泛最后值得一提的是极性或弱极性大孔吸附树脂，它们对于非离子性有机化合物的吸附性能颇佳，适用于非离子性天然产物的分离与纯化[21]北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文7 第二章、离子交换大孔吸附树脂吸附分离苦豆子生物碱2.1 实验试剂与仪器2.1.1 主要设备与仪器HZS-H 水浴振荡器（哈尔滨市东联电子开发有限公司） ；722S可见分光光度计、pHS-3B 型酸度计、电子天平、 FA1004N 分析天平（上海精密科学仪器有限公司） ；铁架台、蝴蝶夹、层析柱、具塞三角瓶、移液管、分液漏斗等2.1.2 实验材料与试剂CD-180（天津南开大学化工厂） 、X-5、CAD-40、D113、D151、D152（安徽三星树脂科技有限公司） 六种离子交换大孔吸附树脂；提取液原液 （紫金花药业公司提供）； 氢氧化钠（天津科密欧化学试剂有限公司） 、 盐酸（北京化工厂） 、氯化钠（西安化学试剂厂） 、无水乙醇（烟台双双化工有限公司） 、磷酸二氢钾、溴麝香草酚蓝 (天津天新精细化工开发中心)、苦参碱 (中国药品生物制品检定所)、氯仿（均为分析纯）。

2.1.3 树脂的预处理取六种树脂各 35mL 置入三角瓶中，加入蒸馏水浸泡24h，待其充分溶胀；然后倒掉蒸馏水加入150mL 的 0.1mol/L 氢氧化钠溶液浸泡2h， 再用蒸馏水洗至中性；再用 0.1mol/L 的盐酸溶液 150mL 浸泡 2h，后用蒸馏水洗至中性待用2.2 实验方法2.2.1 标准工作曲线的绘制2.2.1.1 配置缓冲液及酸性染料北方民族大学化学与化学工程专业2010 届本科毕业生毕业论文8 准确称取磷酸二氢钾1.3609g，氢氧化钠 0.3376g分别置于 500mL 容量瓶中用蒸馏水定容至刻度待用；将氢氧化钠溶液和磷酸二氢钾溶液混合，用pH 计调pH 至 7.60 即得缓冲溶液，缓冲液放在广口瓶中待用再准确称取0.0625g溴麝香草酚蓝，加入 1000mL 缓冲液即得酸性染料，酸性染料放在棕色瓶中待用2.2.1.2 绘制标准曲线精密称取苦参碱样品0.0051g，置于 50mL 容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度， 摇匀即得苦参碱标准液 分别取标准液 0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL 置于 125mL 的具塞三角瓶中，挥尽乙醇，加入酸性染料和氯仿各6.00mL，密塞。