VEGF的分子生物学基础及作用机制.ppt

成都康弘生物科技有限公司,,心血管系统,血管发生与血管新生,生理性血管新生,生理条件下的血管新生受到严格的控制,血管新生的调控,病理性血管新生,病理条件下的血管新生现为高度失调,病理性血管新生,病理条件下的血管新生现为高度失调,,初期 许多体内外的刺激使得促血管生成因子分泌增加，在局部积聚，诱导血管新生能引起这一变化的刺激有血管损伤、创伤、缺氧、肿瘤生长、局部炎症反应和某些细胞因子 增生侵入期 蛋白酶降解细胞外基质(extracellular matrix ECM)，松解内皮细胞与周围组织的粘附，内皮细胞增生、迁移和浸润 成熟分化期 包括血管管腔形成，内皮细胞分化，血管结构的修整、改建，毛细血管网可根据组织需要进一步增生变密或退化变疏，成熟的血管最终形成,血管新生的分期,促血管生成因子参与了整个血管新生的过程,VEGF（血管内皮生长因子） Vascular Endothelial Growth Factor,是一类多功能的细胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用 VEGF的功能 ①促进血管内皮细胞增殖、血管生成 ②增加血管通透性 ③具有促炎性反应的活性 ④具有神经保护作用,Leung DW, et al., Science(1989) 246: 1306.,通过二硫键共价连接的反平行同源二聚体 二聚体形成的决定簇位于VEGF起始的 110残基处 氨基端 α- 螺旋 12 位组氨酸和 19 位天冬氨酸间形成的结构域对 VEGF 二聚体形成起着关键作用 VEGF单体间的疏水性氨基酸的相互作用可以稳定或协助二聚体的形成 每个亚基的分子量为17～22 kD 等电点为8.5，有很强的耐热和耐酸能力,VEGF（血管内皮生长因子） Vascular Endothelial Growth Factor,VEGFs,,VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E,PlGF,VEGF-F,,VEGF121 VEGF165 VEGF189 VEGF206,自由循环,结合在有糖蛋白的硫酸肝素上,胎盘生长因子,50%以可溶性形式分泌至胞外,其余部分和细胞膜或基底膜上含有肝素或硫酸乙酰肝素的蛋白多糖紧密结合,VEGF（血管内皮生长因子） Vascular Endothelial Growth Factor,（Placenta Growth Factor）,VEGF-A的生物学作用,在生理条件下，VEGF-A在胚胎发育，早期的生长发育，骨骼生长及卵巢的血管新生中起着重要作用 ---抑制单独一条VEGF等位基因导致大鼠胚胎在11-12天死亡1 ---部分或全部抑制VEGF导致新生大鼠死亡率增高、早期发育障碍，器官发育障碍、肾衰等2 在病理条件下，VEGF-A与多种疾病关系密切 ---实体肿瘤的生长、转移；眼部新生血管综合征（湿性AMD，糖尿病视网膜病变，视网膜静脉阻塞等）；炎症反应及脑水肿；女性产道病理3,Carmeliet P et al., Nature (1996) 380: 435 – 439 Gerber HP et al., Development (1999) 126: 1149 – 1159 LeCouter J et al., Nature Medicine (2003) 9: 669 - 676,,参与新生血管形成、使血管的通透性增加,各种异构体间功能上的差异表现为它 们 与 细 胞 外基质中肝素结合活性不同 VEGF121 为可溶性分泌蛋白，不与肝素结合，易自由扩散； VEGF165 具有肝素结合序列，部分以可溶性方式分泌到细胞外，具有较弱的肝素结合力，促血管活性最强的亚型 VEGF189、VEGF206 具有较强的肝素亲和力紧密结合在有糖蛋白的硫酸肝素上，从而结合在细胞上或者以生物失活状态阻滞在细胞外基质直至被特定的蛋白酶动员,VEGF-A的生物学作用,VEGF-B的生物学作用,对病理性新生血管的存活起关键作用,PlGF的生物学作用,和多种细胞结合并调节其功能,Carmeliet B and Dewerchin M Cold Spring Harb Perspect Med (2012) 2: 1-24,,,,,VEGF,,VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E,PlGF,VEGF-F,VEGFR,,,VEGF121 VEGF165 VEGF189 VEGF206,VEGFR-1 (Flt-1),VEGFR-2 (KDR),VEGFR-3 (Flt-4),,VEGF/VEGFR引起血管新生的机理,结合,,RTKs（受体酪氨酸激酶） Receptor Tyrosine Kinase,,典型的跨膜镶嵌式蛋白，平时以单体形式存在 胞外区为7个超二级结构的免疫球蛋白，这7个免疫球蛋白样结构从N端开始依次命名为D1-D7 跨膜区是单次跨膜的α螺旋 胞内区为2个酪氨酸激酶区，可以发生自磷酸化来向下游传递信号,VEGFR（血管内皮生长因子受体） Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,VEGFR主要有3种亚型,VEGFR（血管内皮生长因子受体） Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,,,,,,,VEGFR（血管内皮生长因子受体） Vascular Endothelial Growth Factor Receptor,,VEGF,,VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E,PlGF,VEGF-F,VEGFR,,,VEGF121 VEGF165 VEGF189 VEGF206,VEGFR-1 (Flt-1),VEGFR-2 (KDR),VEGFR-3 (Flt-4),,VEGF/VEGFR引起血管新生的机理,结合,,VEGF/VEGFR介导的信号通路的作用机制,,VEGFR主要激活两条信号途径传递信号：Raf-Mek-Erk途径（ 启动DNA合成和内皮细胞生长），PI3K-Akt途径（促细胞存活）,VEGF/VEGFR介导的信号通路的作用机制,,,,,,,,,,,,VEGF/VEGFR引起血管新生的机理,针对VEGF/VEGFR的药物研发,,,,,,途径1：阻断VEGF,途径2：阻断VEGFR,途径3：抑制RTK,抗VEGF药物阻断VEGF信号传导,抗体类,融合蛋白类,,贝伐单抗 Bevacizumab,雷珠单抗 Ranibizumab,阿柏西普 Aflibercept,康柏西普 Conbercept,,核酸适体类,哌加他尼Pegaptanib,核酸适体类药物,经体外SELEX技术筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段,哌加他尼的结构及作用机制,一种聚乙二醇修饰的寡聚核苷酸，含有28个碱基，具有特点的三维结构，分子量为50kD 与VEGF165特异性的结合，阻止了VEGF165 与VEGFR-2的结合 ，由此阻断了VEGF165 介导的信号传导和钙动员，抑制了血管的新生 2004年12月FDA批准其用于 w- AMD的治疗,抗VEGF药物阻断VEGF信号传导,抗体类,融合蛋白类,,贝伐单抗 Bevacizumab,雷珠单抗 Ranibizumab,阿柏西普 Aflibercept,康柏西普 Conbercept,,核酸适体类,哌加他尼Pegaptanib,抗体（antibody）,抗原结合片段（fragment antigen binding， Fab）,可变区（fragmentvariable，Fv） 恒定区,可结晶片段（fragment crystallizable，Fc）,是由抗原刺激机体后所形成的一类具有与该抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白（immunoglobubin，Ig）,2-3个恒定区,单克隆抗体技术,,单克隆抗体的结构改良,贝伐单抗的结构及机制,重组的全长人源化单克隆抗体，分子量为149kD，包含了人源抗体的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区 贝伐单抗能与VEGF-A的所有亚型结合，抑制内皮细胞有丝分裂，减少血管通透性，从而阻断新生血管的形成 2004年2月26日获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。

最早被批准用于直肠癌的治疗，在恶性肿瘤的治疗中发挥重要作用 随着对其结构、机制以及大量临床实验的不断研究，它的适应范围越来越广泛在眼科领域，它被用于血管增生性疾病治疗，并且取得了很好的治疗效果许多研究表明玻璃体注射Avastin是安全有效的给药方式，玻璃体给药后的短期观察表明，Avastin对血压以及眼压的影响较小,雷珠单抗的结构及机制,一种单克隆抗体片段（Fab）， 其与贝伐单抗是从相同亲本鼠抗体获得它比母体分子小得多，分子量为48kD，具有更好的穿透力 Fc片段的缺失缩短了该抗体的半衰期，并能减轻Fc片段相关的免疫反应 竞争性地与VEGF-A的所有亚型结合，由此发挥抗渗透及抗血管生成的功能 2006年6月FDA批准的第一种用于治疗眼部疾病的抗VEGF的蛋白类药物，用于治疗w-AMD,抗VEGF药物阻断VEGF信号传导,抗体类,融合蛋白类,,贝伐单抗 Bevacizumab,雷珠单抗 Ranibizumab,阿柏西普 Aflibercept,康柏西普 Conbercept,,核酸适体类,哌加他尼Pegaptanib,免疫球蛋白融合蛋白,将目的蛋白的结构基因与Ig基因相连，在原核或真核细胞中表达的具有双重功能的重组蛋白。

根据重组时利用的Ig基因的片段不同，可将其分为二大类,Fab(Fv)融合蛋白 Fc融合蛋白,Fc融合蛋白的特点,Fc融合蛋白类药物是将IgG中的Fc片段作为融合伴侣，通过DNA重组技术将其直接连接到另一个活性分子上所研制的药物,延长药物作用时间 保留了融合对象的生物活性 具有Fc的抗体活性 提高蛋白或多肽类药物的稳定性 使后期纯化工艺变得简便易行,抗VEGF的融合蛋白,VEGFR-1 VEGFR-2,,,,,阿柏西普的结构及机制,可溶性重组VEGFR蛋白，融合了人源VEGFR-1Ｄ2和VEGFR-2Ｄ3以及人源lgG的Fc段，分子量为115kD 跟贝伐单抗相比，可以全面结合VEGF-A，VEGF-B及PlGF ，并且在玻璃体内具有较长的半衰期 2011年FDA批准用于治疗w-AMD,康柏西普的结构及机制,VEGFR-2,,VEGFR-1 Kd 10-30 pM,VEGFR-2 Kd 100-300 pM,Lumitin,Kd = 0.5 pM,全人源化融合蛋白，融合了人源VEGFR-1Ｄ2和VEGFR-2Ｄ3、Ｄ4以及人源lgG的Fc段，分子量为142kD 全面结合VEGF-A，VEGF-B及PlGF 新一代抗VEGF融合蛋白，中国首个获得世界卫生组织国际通用名的拥有全自主知识产权的生物Ⅰ类新药 2013年批准上市用于治疗w-AMD,康柏西普的结构及机制,VEGF-A结合在VEGFR1的D2区和VEGFR2的D3区的连接处 含有D4区的康柏西普其二聚体样结构更稳定，更方便VEGF的桥接，也具有更快的VEGF结合速度,Wu Z,, et al. 2013, PLoS ONE 8(3): e57642.,康柏西普与VEGF-A的结合模型,,,康柏西普的结构及机制,VEGF-A,抗体类,融合蛋白类,核酸适体,五种抗VEGF药物的结构及机制,,@wangchen.,。