细菌的分离与培养.docx

细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯实验内容：一、 平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一 点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的若需从平板上获取纯种，则挑取一个单 个菌落作纯培养用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、 右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环2、 左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空 中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的 1/5-1/6,此为第一区划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划 破琼脂3、 接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定）， 待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区4、 第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

5、 划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分 布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）二、 液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种可以观察细菌不同的生长性状、生化特 性以供鉴别之用操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落1、 左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞， 将管口移至火焰上旋转烧灼2、 将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液 体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）3、 管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出 观察生长情况三、 半固体穿刺接种法用途：观察细菌动力，保存菌种方法：1、 以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下试管置37C温箱孵育18-24小时，取出后 对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等图5液体（左）及半固体（右）培养基接种法四、 斜面培养基接种法用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。

操作方法：1、 以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回 作蜿蜒划线2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下置37°C温箱孵育18-24小时，取出 观察斜面上菌苔生长情况细菌分离培养及移植在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环分离培养的目的主要是在含多种 细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌在分离培养时应注意：选择适合于所分 离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等同时应严格按无菌操作程序进行 实验，并做好标记［目的要求］(1) 掌握细菌分离培养的基本要领和方法2) 掌握厌氧菌培养的原理及其方法［实验材料］菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环 (以上每人一套)［需氧性细菌分离培养法］1. 划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法平板划线培养的方法甚多， 可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独 立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状划线培养时须注意 以下几点：图5-1琼脂平板上各种方式的划线培养法(1) 左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20。

左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中 将培养基污染)2) 右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂 布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后， 再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-1)3) 划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基图5-2手持试管法(4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37°C培 养2. 纯培养的获得与移植法将划线分离培养37C24h的平板从温箱取出，挑取单 个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂 斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验 等具体操作方法如下：（1） 两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐， 管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出（图5—2） 右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞， 将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰（图5—3）将接种环伸入菌种管内，先在 无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸入另一管 斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。

从斜面底部开始划曲线，向 上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好（图5—4）接种完毕，接 种环通过火焰灭菌后放下接种棒最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接种者， 置37°C温箱中培养2） 从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接 种棒，将接种环火焰灭菌，左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，左手盖上平皿盖后 立即取斜面管，按上述方法进行接种、培养3. 肉汤增菌培养为了提高由病料中分离培养细菌的机会，在用平板培养基做分 离培养的同时，多用普通肉汤做增菌培养，病料中即使细菌很少，这样做也多能 检查出另外用肉汤培养细菌，以观察其在液体培养基上的生长表现，也是鉴别 细菌的依据之一其操作方法与斜面纯培养相同：无菌取病料少许接种增菌培养 基或普通肉汤管内于37C下培养4. 穿刺培养半固体移植用穿刺法接种方法基本上与纯培养接种相同，不同的 是用接种针挑取菌落，垂直刺人培养基内要从培养基表面的中部一直刺入管底， 然后按原方向退出即可5. 倾注培养法取3支融化后冷却至45C左右的琼脂管，用接种环取一环培养物 移至第一管内，摇匀从第一管取一接种环至第2管，振荡再由第2管取一接 种环至第3管，混匀。

将3管含有培养物的琼脂分别倒入3个灭菌培养皿内做成 平板，凝固后倒放于37C恒温箱内培养，24h后观察结果第一管的平板菌数甚 多，而第2、第3管之平板则渐渐减少，此法现在应用较少6. 芽孢需氧菌分离培养法若怀疑材料中有带芽孢的细菌，先将检查材料接种于 一个含有液体培养基的试管中，然后将它置于水浴箱，加热到80°C，维持15〜 20min，再行培养材料中若有带芽孢的细菌，其仍能存活并发育生长，不耐热 的细菌繁殖体则被杀灭7. 利用化学药品的分离培养法抑菌作用：有些药品对某些细菌有极强的抑制作 用，而对另一些细菌则无效，故可利用此种特性来进行细菌的分离，例如通常在 培养基中加入结晶紫或青霉素抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离革兰氏阴性菌杀菌作用：将病料如结核病病料加入15%硫酸溶液中处理，其他杂菌皆被杀死， 结核菌因具有抗酸活性而存活鉴别作用：根据细菌对某种糖具有分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别 某种细菌例如SS琼脂培养基可以用做鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌8. 通过实验动物分离法当分离某种病原菌时，可将被检材料注射于敏感性高的 实动物体内，如将结核菌材料注射于豚鼠体内，杂菌不发育，而豚鼠最终患慢性 结核病而死。

实验动物死后，取心血或脏器用以分离细菌有时甚至可得到纯培 养［厌氧性细菌的分离培养法］厌氧菌需有较低的氧化一还原势能才能生长（例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化一 还原电势降低至0.11V时才开始生长），在有氧的环境下，培养基的氧化一还原 电势较高，不适于厌氧菌的生长为使培养基降低电势，降低培养环境的氧压是 十分必要的现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学、化学和物理学3种方法， 可根据各实验室的具体情况而选用1. 生物学方法培养基中含有植物组织（如马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组 织（新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等），由于组织的呼吸作用或 组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气（如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能 消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理），组织中所含的还原性化合 物如谷胱甘肽也可以使氧化一还原电势下降另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后， 使厌氧菌能生长其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌（如枯 草杆菌），另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密 封，置37C恒温箱中培养2〜3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。

2. 化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用 还原氧化型物质，降低氧化一还原电势李伏夫（B.M.JIbbob）法此法系用连二亚硫酸纳（Sod~Lkrn hydrosulphite）和碳 酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S2O4 + Na2C03 + O2Na2SO4 + Na2SO3 + C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系 液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1〜2个平皿的空间(视玻罐的 体积而定)，按玻罐的体积每1 000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在 纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免 罐内水分过多若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐 罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭(如图5-5)焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量氧气，同时由淡棕变为深 棕色的焦性没食橙(Purpurgallin)每100cm3空间用焦性没食子酸1g及10%氢氧化纳或氢氧化钾10ml，其具体方 法主要有下列几种：(1) 单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。

取方形玻璃板一块，中央置纱 布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸0.2g及10%NaOH溶液0.5mL 迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封将此玻璃板 连同培养皿放入37°C温箱培养24〜48h后，取出观察2) Buchner氏试管法(图5—6):取一大试管，在管底放焦性没食子酸0. 5g及 玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入20% NaOH溶液0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡°37C培养 24〜48h后观察3) 玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培 养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶 液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触， 待一切准备好后，将线放下，使焦性没食子酸落入氢氧化纳溶液中，立即将盖盖 好，封紧，置温箱中培养4) 瑞(wright)氏法：将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后， 塞入管中离培养基1〜1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH 溶液2ml,迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养(图 5—7)。