分子生物学实验课：转染绿色荧光蛋白表达载体.ppt

转染绿色荧光蛋白表达载体转染绿色荧光蛋白表达载体•绿色荧光蛋白（GFP)是1962年从水母中发现的一个荧光蛋白，1992年被克隆，近年得到广泛应用其分子中的发光基团对蓝色光照特别敏感当它受到蓝光照射时，会吸收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光 •美籍华人钱永健在1995年完成的单点突变（S65T）这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强突变后的GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力•而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP•其他的突变还包括颜色突变，这其中大部分也是钱永健的功劳现在有蓝色荧光蛋白（EBFP）、青色荧光蛋白（ECFP）和黄色荧光蛋白（YFP）•于2008年获得诺贝尔奖•作为一种新型的报告基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用•将GFP作为蛋白质标签，即利用DNA重 组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察•利用GFP来检测目标蛋白的定位为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

 •肿瘤发病机制的应用•GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件转染原理•脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的在水中可以自动生成闭合的双层膜，最初 ,人们只是运用脂质体模拟生物膜 ,研究膜的构造及功能 ,后来发现了膜的融合膜的融合及内吞作用及内吞作用 ,因而可用作外源物质进入细胞的载体•现商品化的脂质体通常都是阳离子脂类和中性脂类的复合体其中以阳离子脂类起主要作用，阳离子脂质体既能与DNA可以通过静电作用形成脂－DNA复合物，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附从而引导DNA进入细胞•本次用脂质体为invitrogen公司Lipofectamine® 2000  转染步骤：转染步骤：•每组做2孔•培养好的细胞接种细胞孔板，37℃的CO2培养箱培养，待细胞密度为80%左右，约24h后取出细胞孔板，吸出旧培养基，每孔加入250μl新培养基，重新放入培养箱待用   下列数据均为每孔加入量•1.待转染质粒PEGFP-C1与脂质体混合物制备：    a. 取1.5ml离心管，加入无血清OPTI-MEM培养基 25μL，然后加入质粒 0.4μg。

轻轻混匀，静置5min    b．取1.5ml离心管,加入无血清OPTI-MEM培养基25μL 加入脂质体1μL，轻轻混匀，静置5min    c ．将以上两管内容物混在一起，轻轻混匀，室温静置20min•2.到时间后，将50μL混合物加入细胞中轻轻混匀，37℃的CO2培养箱培养次日观察绿色荧光。