硫醇类荧光探针研究进展.doc

1硫醇类荧光探针研究进展作者：尹伶灵 陈蓁蓁 佟丽丽 徐克花 唐波【摘要】 硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用，定量检测硫醇在生物化学和临床化学中具有重要的意义荧光法由于其具有灵敏度高、能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪的优点，成为目前广泛采用检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段本文引用文献5１篇，按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景 【关键词】 硫醇，荧光探针，综述Abstract Thiols, which are components of many proteins and simple molecules, play an important role in the cellular antioxidant defense system. The quantitative determination of thiols is important in biochemistry and clinical chemistry. Fluorescent probes, which have its apparent advantages in sensitivity and, most importantly, in imaging thiols in vivo, even in single living cells, appear to be particularly attractive. In this review, we classify the fluorescent probes based on their different reaction mechanisms with thiols and summarize the recent progresses of thiols fluorescent probes with fifty one references. Particularly, the research actuality, the developing trends and prospects in the future were also discussed.Keywords Thiols, fluorescent probe, review1 引 言硫醇是生物体中许多蛋白质和小分子的重要组成部分，在细胞的抗氧化系统中具有重要的作用[1]。

小分子硫醇包括半胱氨酸（Cys）、谷胱甘肽（GSH）、硫辛酸和辅酶 A;大分子硫醇包括含巯基的多肽、酶和生物膜大量的生物现象被认为依赖于这些包含巯基的硫醇类物质，如氧化还原反应、甲基转移反应、二氧化碳固定反2应以及辅酶 A 参与的反应等[２]谷胱甘肽（GSH）是细胞内含量最高的小分子硫醇（1~10 mmol/L）[３~５],它存在氧化型谷胱甘肽（GSSG）和还原型 GSH 的氧化还原动态平衡[６]大量资料显示[７~1１]，谷胱甘肽在维持细胞的氧化还原动态平衡、氧化应激和在细胞的生长、功能中起着重要作用，而且谷胱甘肽的水平还与许多疾病和癌症有着直接的联系因此，定量检测生物体系中硫醇的浓度在生物化学和临床化学中具有重要意义目前已报道的用于检测硫醇的方法主要有：高效液相色谱法[1２~1４]、电化学法[1５~1７]、荧光法等荧光法由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动态响应范围宽的特点，更重要的是能够实现对活体甚至单个细胞的实时可视化示踪，成为目前广泛采用的检测细胞内硫醇类物质的一种重要手段本文按荧光探针与巯基作用机理的不同分类，就近年来该领域的研究进展做了比较系统的评述，并展望了此类探针的发展趋势和应用前景。

２ 利用巯基的亲核性检测硫醇的荧光探针2.1 利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇利用巯基对缺电子双键的亲核加成反应检测硫醇的探针主要为氮取代的马来酰亚胺类衍生物马来酰亚胺通常易与硫醇类化合物发生亲核加成反应，在室温下pH 5~8 时几分钟即可完成Kanaoka 等发现氮取代的马来酰亚胺类的大多数化合物自身没有荧光或荧光很弱，当它与包含巯基的化合物反应后形成具有强荧光的加成产物[1８,１９]， 并于 1970 年开发了第一个比较实用的马来酰亚胺类荧光试剂 1［２０］试剂 1 是一个非常灵敏的检测巯基类化合物的荧光试剂，缺点是激发3和发射均处于紫外区，且水溶性差经过对荧光发射团系统的研究后，Machida 等 [2１]又进一步开发了波长较长水溶性较好的试剂 2试剂 2 的激发和发射波长分别为 400 和 480 nm，该探针在设计时为了增加水溶性引入了极性的香豆素荧光团和二甲氨基基团试剂 1 和 2 被称为 Kanaoka 试剂，通常被用作荧光探针来共价标记蛋白质中的巯基活性点近年来，许多氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针被开发[2２~2８]，用来检测动物血清、肝脏、尿液等生物样品中的 GSH、Cys 等具有重要生物学意义的小分子硫醇。

1995 年 Langmuir 等[2２]设计合成了 5 个以苯并香豆素（naphthopyranone）为母体荧光团的氮取代的马来酰亚胺类硫醇荧光探针 4~8，这些探针与一些小分子硫醇如 GSH、Cys 等在生理 pH 条件下立即反应，脂肪族胺、氨基酸和非硫醇蛋白不干扰测定他们将这 5 个探针与广泛使用的硫醇类荧光探针 3[2３]比较，研究了其与硫醇反应前后荧光量子产率的变化，结果显示其与硫醇反应后荧光量子产率显著增大（其中试剂 8 荧光量子产率变化最大，0.012~0.66），是比试剂 3（0.021~0.13）更为灵敏的探针Liang 等组设计合成探针 5 maleimidyl 2 (m methylphenyl)benzoxazole（MMPB）[24,25]，与其它马来酰亚胺类探针相比，由于 MMPB GSH 和 MMPB Cys 荧光性质的不同，该探针可以实现对 GSH 和 Cys 的选择性响应在激发和发射波长分别为 299.2 和 355.8 nm 时，MMPB 可以选择性的检测 GSH，在含有 0.4 倍的 Cys 的情况下对 GSH 的检出限可达 3.23×10－10 mol/L，其它氨基酸 100 倍存在时不干扰测定。

该探针被成功用于人的血液、猪肝和猪心中 GSH含量的测定；在激发和发射波长分别为 305.6 和 425.6 nm 时，MMPB 还可选择性4的检测 Cys在同时存在 0.15 倍的 GSH 的条件下对 Cys 的检出限可达6.2×10－10 mol/L，其它氨基酸 100 倍存在时不干扰测定该探针被成功用于蛋白质水解液、胱氨酸电解液和人尿液中 Cys 的测定，回收率高、重现性好该探针虽然可以实现对 GSH 和 Cys 的选择性响应，但激发和发射波长短，生物样品中背景荧光干扰比较大该课题组 2005 年又设计合成了一个新的波长较长的荧光探针9[26]，激发和发射波长分别为 401 和 496 nm试剂 9 用于检测 Cys 线性范围1.0×10－8~6.0×10－7 mol/L,检出限 5.7×10－9 mol/L；检测 GSH 线性范围6.0×10－9~4.0×10－7 mol/L,检出限 5.64×10－9 mol/L试剂 9 被成功应用于检测人血清和血浆中的 GSH，人尿液中的 Cys，回收率 96.2%~103.0%试剂 9 用于检测巯基类物质简单快速、可行性强，35 ℃时 15 min 即可反应完全，且与前一个探针 MMPB 相比波长较长，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰。

Matsumoto 等[27]设计合成了基于 PeT（光诱导电子转移）机理的绿色荧光探针o maleimideBODIPY（10），该探针的荧光被供体 BODIPY 到受体 maleimide 的激发态光致电子转移过程（d PeT）强烈猝灭，与硫醇类物质反应后荧光团 BODIPY的荧光恢复，荧光增强 350 倍，反应前后荧光量子产率变化比较大（0.002~0.73）该探针是目前所见的马来酰亚胺类硫醇荧光探针中除荧光素马来酰亚胺（fluorescein 5 maleimide）外，唯一在可见光区激发和发射的探针，且信噪比远高于 fluorescein 5 maleimide[28]（荧光增强倍数仅有十倍，荧光量子产率变化为 0.06~0.64） 探针 10 可以用来清楚定量地标记极低浓度的牛血清蛋白（牛血清蛋白最低浓度为 5 mg/L）探针 10 由于激发和发射波长均处于可见光区，可以极大的减少生物样品中本体自发荧光的干扰，但是仍没有应用到细胞内进行检测到目前为止，该类探针应用于细胞内成像的还未见报道5氮取代的马来酰亚胺基团对硫醇类物质选择性好、灵敏度高，是适于检测硫醇的活性基团因此，改善传统荧光团，开发长波长、长寿命以及双光子激发的氮取代的马来酰亚胺类荧光分子探针，使其更适用于生物活体内检测硫醇或标记硫蛋白，是今后该类探针发展的一个重要方向。

Ahn 等[29]采用固相文库合成法合成出一系列的罗丹明类荧光化合物，并从中筛选出可高选择性的与谷胱甘肽响应的荧光探针 11试剂 11 在生理条件下(pH 7.4 HEPES 缓冲液中)与 GSH 发生亲核加成反应使荧光增强，30 min 即可达荧光最高点荧光最大增强 11 倍，荧光量子产率由 0.033 升高到 0.28GSSG 无荧光增强现象，包含巯基的其它分析物（例如 DDT、巯基乙醇、Cys）有荧光弱增强现象但是不影响测定探针被成功应用于实时检测活的成肌细胞（3T3 cells）中的 GSH 浓度的变化，通过加入增加细胞内 GSH 浓度的硫辛酸和减少 GSH 浓度的 NMM，发现荧光强度发生显著变化，证明其探针能够对细胞内 mmol/L 的 GSH 产生响应2.2 利用巯基对缺电子芳环的亲核取代反应（ArSN）检测硫醇Maeda 等[30]以荧光素为母体荧光团，设计合成了 2 个荧光素磺酸酯的硫醇荧光探针 12 和 132,4 二硝基苯磺酰基（DBS）强吸电子作用将荧光素的荧光猝灭，由于巯基的强亲核作用发生 ArSN 反应，磺酸酯键断裂，荧光团母体结构恢复，荧光增强探针与 GSH 反应在 37 ℃生理条件（HEPES， pH 7.4）下，10 min 即达到荧光最大值，探针 12 和 13 的反应速率分别为 1.7×102 和 1.4×102 mol/(L·S)，检出限可达 pmol/L。

探针虽然在水溶液中存在水解副反应，但对测定影响不大（37 ℃生理缓冲液中 1 h 探针 12 和 13 分别仅水解 0.7%和 1.1%）6Zhang 等[31]设计合成了一个在可见区激发的荧光增强型的可选择性检测半胱氨酸（Cys）和同型半胱氨酸（Hcy）的探针 14该探针激发和发射波长分别为 465 和588 nm，荧光最大增强可达 75 倍更为突出的是该探针可用作 Cys 和 Hcy 的裸眼探针，加入 Cys 或 Hcy 后溶液颜色发生明显变化（由黄绿色变为橘红色）（图 1）,其它 18 种氨基酸无明显颜色变化探针利用巯基的亲核性，在温和条件下（25 ℃，V（甲醇）∶V（HEPES 缓冲液，pH 7 0）=7∶3）反应 10 min 即可完成由于位阻效应，其它硫醇在此条件下几乎不发生反应ACCM 细胞激光共聚焦成像实验显示探针膜渗透性好，可以显示 Cys 和 Hcy 亚细胞分布更为突出的是该探针可用于双光子荧光成像，可以极大地减小对细胞的光损伤、提高光穿透的深度、降低细胞内本体自发荧光的干扰Jiang 等[32]利用荧光团 NBD Cl 设计合成了一个利用磺酰胺检测硫醇的荧光探针 15，由于烷基硫醇与苯基硫酚 pKa 的不同（分别为 8.5 和 6.5），在中性条件下烷基硫醇几乎不能电离。