西沙诺丽果关键发育期主要活性物质及其含量变化分析.docx

    西沙诺丽果关键发育期主要活性物质及其含量变化分析    景瑞雪 孔凡华 白沙沙 田亮 崔亚娟 刘洋摘 要：目的：研究关键发育期诺丽果中主要活性物质的动态变化方法：采用高效液相色谱技术分别检测青果期、硬白果期和熟果期3个熟期的西沙诺丽果实中车叶草酸、去乙酰车叶草酸、东莨菪亭、槲皮素等活性成分及其含量结果：车叶草苷酸、去乙酰车叶草苷酸、东莨菪亭、槲皮素均能够在3个熟期的诺丽果实中检测到诺丽的熟度对主要活性物质的含量有显著影响，不同熟期的去乙酰车叶草苷酸、东莨菪亭和槲皮素的含量两两之间都差异显著，硬白果期、熟果期与青果期的车叶草苷酸的含量差异显著（P<0.05）4种活性物质的含量均随果实的成熟而不断增加，熟果期的4种主要活性物质的含量分别达到58.422 7 、110.765 0、13.545 5 、0.166 2 mg/100 g，青果期到硬白果期诺丽果中上述活性物质的含量变化较大结论：本研究为如何在不同功能导向的诺丽产品生产加工过程中合理选择不同熟度的诺丽果原材料提供科学依据Key：诺丽;化学成分;生长期;含量测定;高效液相色谱诺丽为茜草科巴戟天属植物，其根、茎、叶、果实具有治疗皮肤疾病、伤口感染、心脏病、糖尿病、关节炎、高血压、消化不良、口腔溃疡等功效[1-4]。

目前，本土诺丽果在中国海南、西沙群岛、中国台湾等地大量种植现代药理学证实，诺丽果中含有多糖、酚类、蒽醌类、环烯醚萜类等功效成分，具有抗衰老、抗氧化、抗菌、抑制癌细胞生长等作用[5-8]车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸是诺丽中两种主要环烯醚萜类活性物质，研究表明，车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸变、保肝等药理功效，已经成为诺丽产品的质量评价指标和标志性活性成分[9-11]西沙诺丽果汁多酚的平均含量高达114.12 mg/100 mL，从诺丽果中分离到的多酚类物质主要有黄酮、香豆素、木质素等[12]梁寒峭等[13-14]研究发现，西沙诺丽果汁中香豆素含量在0.176～0.243 mg/mL内，并且已有报道将东莨菪素作为诺丽果汁的质量分析方法研究证实，东莨菪亭对脂肪合成酶、黑色素、肿瘤的生成有明显的抑制作用，并且是诺丽果发挥抗血管生成活性的主要有效成分之一[15-17]槲皮素具有抗氧化、降脂减肥、降血糖、抗肿瘤、抗炎症等多种生理活性沈宋利等[18-21]在美国关岛诺丽果粉中检测出槲皮素的含量为0.10 mg/g近年来，国内外对诺丽果的衍生产品中化学成分的研究较多，且多集中于多糖、蒽醌、多酚、环烯醚萜等总量的提取与测量，对诺丽果原材料的研究鲜见报道。

结合以上情况，本研究以我国本土诺丽品种——西沙诺丽的果实作为研究对象，追踪西沙诺丽果关键发育期主要活性物质的动态变化，旨在为诺丽果原材料的实时采收、质量控制以及缩短诺丽产品生产成本与周期提供科学依据1 材料与方法1.1 材料与试剂去乙酰车叶草苷酸对照品，纯度≥98%;车叶草苷酸对照品，纯度≥95%;槲皮素对照品，纯度≥95%;东莨菪亭对照品，纯度≥95%;乙腈、磷酸，均为色谱级;乙酸、甲醇，均为分析级西沙诺丽果，由海南西沙诺丽生物科技有限公司于2019年9月采集与提供1.2 仪器与设备戴安高效液相色谱仪U-3000，紫外检测器;C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;BRAUN粉碎机;超声清洗仪，上海安谱实验科技股份有限公司;Eppendorf5420离心机1.3 方法1.3.1 不同熟度诺丽果中去乙酰车叶草苷酸-车叶草苷酸含量测定 （1）配置标准储备溶液：分别准确称取5 mg去乙酰车叶草苷酸对照品和车叶草苷酸对照品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即为标准储备液2）配置标准工作液：分别移取标准储备液，进行梯度稀释，配置浓度为5 、10 、20、40 、80 μg/mL。

3）样品前处理：准确称取粉碎均匀的样品10 g于50 mL离心管中，加40 mL水混匀，超声提取30 min后，转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀后离心，上清液过0.45 μm滤膜，上机测定4）色谱条件：戴安高效液相色谱仪U-3000，紫外检测器;检测波长237 nm;C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温35 ℃;流动相：乙腈-磷酸水溶液，进样体积10 μL依据表1进行梯度洗脱，对照品色谱图见图1，青果期、硬白果期、熟果期样品色谱图见图2～41.3.2 不同熟度诺丽果中槲皮素-东莨菪亭含量测定（1）配置标准储备溶液：分别准确称取5 mg槲皮素对照品和东莨菪亭对照品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即为标准储备液2）配置标准工作液：分别移取标准储备液，进行梯度稀释，配置浓度为5 、10 、20 、40、80 μg/mL3）样品前处理：准确称取粉碎均匀的样品10 g于50 mL離心管中，加40 mL甲醇混匀，超声提取30 min后，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀后离心，上清液过0.45 μm滤膜，上机测定4）色谱条件：戴安高效液相色谱仪U-3000，紫外检测器;检测图1 去乙酰车叶草苷酸-车叶草苷酸标准色谱图波长346 nm;柱温30 ℃;乙腈-0.5%乙酸水比例为30∶70，流速1.0 mL/min，分析时间20 min，进样量10 μL。

对照品色谱图见图5青果期、硬白果期、熟果期样品色谱图见图6～81.3.3 数据统计 取同一批诺丽果样品，上述步骤重复3次，用SPSS 25.0中One-Way ANOVA对试验数据进行单因素方差分析，采用LSD法进行多重比较，结果用平均数 ± 标准差表示2 结果与分析在诺丽果生长过程中，车叶草苷酸、去乙酰车叶草苷酸、东莨菪亭和槲皮素的含量在不同的熟期差异显著（P<0.05），说明诺丽的熟度对4种物质有显著影响并且不同熟期去乙酰车叶草苷酸、东莨菪亭和槲皮素的含量两两之间都差异显著，硬白果期、熟果期与青果期的车叶草苷酸的含量差异显著（P<0.05）4种标志性功效成分动态变化呈现相似规律，皆表现为青果期最少，硬白果期次之，熟果期达到峰值，含量分别为58.422 7 、110.765 0 、13.545 5 、0.166 2 mg/100 g因此，4种标记性功效成分含量与果实的成熟度呈现正相关性但是，果实的生长过程中其含量上升趋势并非是稳步的其中，青果期到硬白果期的含量有一个快速增长的过程，分别由青果期的11.346 3、25.037 7、2.518 0、0.000 4 mg/100 g激增至56.553 1、103.071 6、12.270 6 、0.166 2 mg/100 g，而硬白果期到熟果期的生长过程中含量增长较为缓慢（表2）。

3 讨论车叶草苷酸、去乙酰车叶草苷酸、东莨菪亭、槲皮素皆是植物正常生長过程中的以C、H、O元素为基础的次生代谢产物，青果期到硬白果期过程中4种活性物质的含量激增模式可能与光合作用中积累过多的C源用于合成以C为基础的次生代谢产物有关[22]lin等[23]研究表明，诺丽果的体积、重量与生长时间呈现线性增长模式，且东莨菪亭的平均含量为每果干重2～3 mg，在果实生长的过程中不断积累，并呈现s型曲线，其含量增长趋势与本研究结果一致刘杰超等[24]、徐贵华等[25]、杜丽娜等[26]研究表明，黄酮类化合物在枣、柑橘果实中含量的动态变化趋势为未成熟期积累，成熟期下降;多酚类化合物在杏果实中含量的动态变化趋势为幼果期为最高，其后随着果实的发育呈逐渐下降趋势，皆与本研究中多酚类化合物——东莨菪亭、槲皮素的持续增长模式有所不同，这与诺丽果实中与多酚等相关合成酶的活性有关植物的生长过程中，随着成熟度的增加，各项化学成分不断变化，因此主要活性物质的含量是判断诺丽果是否适合采收的重要依据国外学者采用高效液相色谱法测得成熟的大溪地诺丽果中车叶草苷酸、去乙酰车叶草苷酸的平均含量分别为3.741、1.253 mg/g，其含量高于本研究中的西沙诺丽果[27]。

但是有研究称，以我国西沙诺丽果为原材生产的果汁中车叶草苷酸的含量明显高于大溪地、澳大利亚等地区[28]，这可能是由于诺丽果成熟度、采收时期、发酵工艺等因素最终影响了活性物质的含量目前，企业为提高诺丽果汁、果粉等营养成分含量与结构，产品发酵原材常使用质地柔软、不易储存的熟果期果实，而熟果期的果实易在自身酶与内生菌的作用下数小时之内迅速软化，甚至因部分液化而渗出果汁，极其不利于运输与储藏[29]为应对这一情况，企业往往根据诺丽种植地区，就近选择场址进行后续的生物发酵，或是在运输途中进行物理低温储藏及使用抑制后熟作用的化学试剂然而，本研究发现，硬白果期和熟果期的果实中主要活性物质的含量差异较小，综合考虑诺丽果产量与品质等因素，硬白果期为最适宜的采收时期近年来，已经有不少证据证明诺丽对人体有相当多的保健功效在一例研究化疗副作用的报告中，连续服用60 d，每日早晚各1 次，每次50 mL的西沙诺丽果汁的鼻咽癌中期患者在化疗期间，机体白细胞和中性粒细胞的骤减、食欲减退及恶心呕吐等副作用随服用时间延长而明显改善[30]Pachauri等[31]构建的小鼠模型显示，印度诺丽干果可通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性增强记忆力，并且含有芦丁、槲皮素、东莨菪亭等提取物同样具有改善记忆力的功效。

Akihisa 等[32]基于细胞实验发现，富含环烯醚萜等13种化合物的果汁可对B16黑色素瘤细胞有明显的抑制作用，在100 mmol/L的浓度下，可使黑色素减少34%～49%，并且无细胞毒性值得注意的是，针对诺丽健康产品与其植物原材料中单体活性成分和含量的检测及研究在国内外尚鲜有报道本研究以我国本土的西沙野生诺丽为研究对象，通过对其3个关键熟期果实中主要单体活性成分及其含量变化的分析，揭示了这些成分在诺丽果中的化学分布及其随果实成熟过程而发生的含量变化规律，研究结果可以为不同功能导向的诺丽健康产品生产加工过程中合理选择不同熟度的诺丽果原材料提供科学依据4 结论本研究表明，车叶草苷酸、去乙酰车叶草苷酸、东莨菪亭和槲皮素的含量均随西沙诺丽果实的成熟而不断增加，青果期到硬白果期诺丽果中上述活性物质的含量变化较大，而硬白果期和熟果期的果实中上述活性物质的含量差异较小，不同功能导向的诺丽健康产品生产加工过程中应合理选择不同熟度的诺丽果Reference[1]Wei-Min Zhang，Wang W，Jing-Jing Zhang，et al. Antibacterial constituents of hainan morinda citrifolia（Noni）leaves[J].Journal of Science，2016，81（5）：1193-1196.[2]José Bégue Moreira de Carvalho，Viana G S B，José Galberto Martins da Costa，et al.Morinda citrifolia l.treatments（noni）reduce glycemia in the model of aloxan-induced diabetes in rats[J].Diabetology & Metabolic Syndrome，2015，7（S1）：45.[3]徐荣，杨朴丽，徐通，等.诺丽果粉增强免疫力功能实验研究[J].食品工业科技，2017，38（24）：297-302.[4]édipo S.Almeida，Débora Oliveira，Dachamir Hotza. Properties and applications of morinda citrifolia（Noni）：A review[J].Comprehensive Reviews in Food 。