沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验（食品微生物学检验）.pdf

GB 4789.312013 1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的 肠杆菌科噬菌体诊断检验 1 范围 本标准规定了应用肠杆菌科噬菌体诊断方法检验食品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌 本标准适用于各类食品和食源性疾病事件样品中沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的检验 本标准适用于食品行业从业人员肠道沙门氏菌和志贺氏菌带菌检验 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌、培养的设备外，其他设备和材料如下： a) 恒温培养箱：36 1 , 42 1 ，50 1 ; b) 厌氧培养装置：41.5 0.5 ; c) 显微镜：10 倍100 倍; d) 水平仪：噬菌体试验的工作台面应调整至水平位置; e) 已灭菌 1 mL 一次性注射器（应为塑料材质） ，针头无编号，使用前测定每滴 5 L10 L（每 mL 有 100200 滴）可用; f) 微量移液器及吸头（10 L 和 5 L）; g) 定量移液器及吸头（100 L 和 50 L）; h) 无菌吸管：10 mL、5 mL、1 mL; i) 无菌毛细管; j) 无菌培养皿：90 mm; k) 无菌棉签; l) 带盖的灭菌小试管：8 mm50 mm; m) 载物玻片。

3 培养基和试剂 3.1 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录 A 中的 A.1 3.2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录 A 中的 A.2 3.3 志贺氏菌（BCT）增菌液：见附录 A 中的 A.3 3.4 营养肉汤（NB） ：见附录 A 中的 A.4 3.5 营养琼脂（NA） ：见附录 A 中的 A.5 3.6 营养半固体琼脂（NSA） ：见附录 A 中的 A.6 GB 4789.312013 2 3.7 三糖铁琼脂（TSI） ：见附录 A 中的 A.7 3.8 葡萄糖铵琼脂：见附录 A 中的 A.8 3.9 肠杆菌科诊断用噬菌体，7 种和 3 种必要时可再购置大肠埃希氏菌分型噬菌体（6 种）一套安 瓿开启后用无菌毛细管吸出移入灭菌小试管内，如果每次使用量很少，可分装于 23 支试管内，保存于 5 冰箱备用 3.10 沙门氏菌因子血清，志贺氏菌分型因子血清，致泻大肠埃希氏菌分型因子血清因子血清的种类 视需要而定 4 检验程序 4.1 沙门氏菌的检验程序 沙门氏菌的检验程序见图 1 GB 4789.312013 3 图 1 沙门氏菌的检验程序 4.2 志贺氏菌的检验程序 志贺氏菌的检验程序见图 2。

ONPG 甘露醇、山梨醇 检 样 O-1 裂解 其他均不裂解 非如左述的 各种反应结果 沙门氏菌 血清学试验证实 非沙门氏菌 沙门氏菌 血清学试验证实 沙门氏菌 血清学试验证实 非沙门氏菌 非沙门氏菌 报 告 前增菌、增菌和分离 挑取可疑菌落 TSI(斜面、底面、产气、H2S) 蛋白胨水（靛基质） 尿素（pH7.2）,KCN,赖氨酸 H2S+,靛基质， 尿素，KCN， 赖氨酸 噬菌体试验 H2S+，靛基质+， 尿素，KCN， 赖氨酸+ 各种噬菌体 均不裂解 非如左述的 各种裂解结果 H2S，靛基质， 尿素，KCN， 赖氨酸+/ ,, , + GB 4789.312013 4 图 2 志贺氏菌的检验程序 Sh 裂解， 并呈现 各种裂解模式 Sh 不裂解 血清学试验与裂解模式相符 且被 1 RTD Sh 裂解 血清学试验与裂模式不相符 或不被 1 RTD Sh 裂解 生化分群试验 葡萄糖铵试验 必要时加做乙酸钠、 克氏柠檬酸盐、 黏液酸、七叶苷、水杨苷试验 志贺氏菌属 分群及分型结果 葡萄糖铵+ 或任何其他阳性结果 非志贺氏菌 报 告 非志贺氏菌 非志贺氏菌 噬菌体试验 非如左述的各 种反应结果 检 样 挑取可疑菌落 TSI， 葡萄糖半固体 增菌和分离 TSI 底层产酸,斜面产碱，H2S 不产气，无动力 GB 4789.312013 5 4.3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序 致泻大肠埃希氏菌的检验程序见图 3。

图 3 致泻大肠埃希氏菌的检验程序 检 样 E 和或 Sh、E4 噬菌体不裂解 其他噬菌体裂解 不同来源分离的菌株 其裂解模式具有同一性 TSI，靛基质， pH7.2 尿素，KCN, 赖氨酸，动力 TSI 底层，H2S, KCN，尿素 非如左述 各种反应结果 血清学试验 ETEC+ 增菌和分离 E 和或 Sh、E4 噬菌体裂解 各种噬菌体均不裂解 氧化酶，G杆菌 EPEC+ 产肠毒素 大肠埃希氏菌 非大肠 埃希氏菌 赖氨酸，靛基质+， 动力(O124 动力+/) 肠毒素+ EIEC+ 非如左述 各种反应结果 非大肠 埃希氏菌 非致泻大 肠埃希氏菌 肠道侵袭性 大肠埃希氏菌 肠道致病性 大肠埃希氏菌 乳糖发酵或不发酵 的菌落 35 个 噬菌体试验 STEC(O157) stx1,stx2,hly+ 产志贺毒素 大肠埃希氏菌 eae+ 报告 GB 4789.312013 6 5 操作步骤 5.1 前增菌、增菌和分离 5.1.1 沙门氏菌的前增菌、增菌和分离按 GB 4789.4 进行。

沙门氏菌增菌液灵敏度的测定见附录 B在 食品行业从业人员的肠道沙门氏菌带菌检验时，采集的标本应增菌，不应前增菌食物中毒标本不应前 增菌，所采集的标本同时做增菌和不增菌步骤 5.1.2 志贺氏菌的增菌和分离按GB 4789.5进行 没有厌氧培养条件的实验室可以采用附录A中的BCT 增菌液食物中毒患者的粪便标本同时做增菌和不增菌步骤 5.1.3 致泻大肠埃希氏菌的增菌和分离按 GB 4789.6 和 GB 4789.36 进行食物中毒标本同时做增菌和 不增菌步骤 5.2 噬菌体试验 5.2.1 培养基的准备 营养琼脂平板 （含琼脂 1%1.5%， 为防止变形杆菌的蔓延生长， 可按 0.02%量加入十二烷基硫酸钠） ， 营养琼脂加热溶化后，加入每个 9 cm 平皿中约 20 mL25 mL，放在水平台面上待其凝固翻转平板， 在 36 1 培养箱内半开皿倒置约 1 h，或 50 1 培养箱内半开皿倒置约 30 min，以烘干培养基 表面水分 5.2.2 试验菌液的准备 5.2.2.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，检验沙门氏菌时，挑取乳糖阴性产 H2S 或不产 H2S 的菌落，和乳糖阳性产 H2S 的菌落。

检验大肠埃希氏菌时挑取乳糖阳性或乳糖阴性的菌 落检验志贺氏菌时挑取典型或可疑菌落分别接种 TSI、半固体和营养琼脂斜面各一管，置 36 1 培养 20 h24 h 后选取三糖铁底层产酸、斜面产碱，不产 H2S，不产气无动力的菌落下述两种方法可 供制备试验菌液时选用 5.2.2.2 方法一：将待检菌落接种于营养肉汤管内，于 36 1 培养 14 h24 h挑取此肉汤培养物 1 满环（约 5 L） ，稀释于盛有 1 mL2 mL 的营养肉汤管内，使成为 1:2001:400 稀释菌液，含菌量约为 1106 CFU/mL 5.2.2.3 方法二：用接种针在鉴别平板上挑取可疑菌落，稀释于盛有 1mL2 mL 营养肉汤管内，含菌 量约为 1106 CFU/mL 5.2.3 涂抹试验菌液 5.2.3.1 斑点涂抹法： 将营养琼脂表面自圆心起分为三等分或二等分， 每等分可供涂抹 1 株细菌培养物 每挑取试验菌液 1 满环，涂抹直径约 1 cm 的菌斑一个每株培养物涂抹菌斑 7 个，外圈 5 个，内圈 2 个 5.2.3.2 棉签涂抹法： 用无菌棉签蘸取试验菌液并略挤去过多液体， 在如上琼脂平板表面三分之一的区 域内涂抹。

三个涂抹区之间保持适当距离，待菌液干燥 5.2.4 滴加噬菌体 用定量为 1 mL 的一次性注射器（针头无编号，1 mL 约有 100200 滴，每滴相当于 5 L10 L） ， 在每一个菌斑上滴加噬菌体或用定量为 10 L 或 5 L 的微量移液器在每一个菌斑上滴加噬菌体一滴， 每滴加一种噬菌体应更换一副注射器或一个吸头，但是每副注射器或每一个吸头可以滴完各株细菌的同 一种噬菌体滴加的噬菌体依次为 O-I、C、Sh、E、CE、E-4 和 Ent滴加噬菌体时应将琼脂平板放在 水平台面上，液滴应悬空滴下，不要污染针头或滴头待 7 种噬菌体均滴加完毕后，略等数分钟待噬菌 GB 4789.312013 7 体液干燥翻转平板，放在 36 培养 5 h6 h，和 14 h24 h 各观察一次结果 如果仅有少数几株细菌作噬菌体试验，可用直径为 3 mm 的接种环挑取噬菌体，每一满环相当于 5 L，依次加在菌斑上，尽量减少在室温放置的时间 5.2.5 试验结果的判定 必要时（例如不能测定到完整的血清型） ，可吸取少许剩余的蛋白胨水培养物作靛基质试验，大肠埃 希氏菌一般为靛基质阳性，沙门氏菌为靛基质阴性。

噬菌体试验的结果见表 1 表 1 噬菌体试验结果 序号 噬菌体裂解模式 判定结果 O-I C Sh E CE E-4 Ent 1 CL - - - - - - 沙门氏菌属 2 CL - - - - CL - 沙门氏菌属(靛基质-),大肠埃希氏菌(靛基质+) 3 - CL - - (-) (-) - 弗劳地氏柠檬酸杆菌群 a 4 - - CL v v v - 志贺氏菌属 b,大肠埃希氏菌 5 CL - CL v v v - 大肠埃希氏菌 6 v - - CL v v - 大肠埃希氏菌 7 - - - - CL v - 弗劳地氏柠檬酸杆菌群 a,大肠埃希氏菌 8 - - - - - CL - 大肠埃希氏菌 9 - (-) v - - - CL 阴沟肠杆菌 0 - - - - - - - 噬菌体不裂解培养物,用生化试验鉴定 注：CL 表示融合性裂解； 表示不裂解； （）表示少量菌株裂解；v 表示裂解或不裂解 a含弗劳地氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、布雷克氏柠檬酸杆菌、沃克曼氏柠檬酸杆菌和吉伦氏柠檬酸杆菌 b按表 3 检索并做血清学分型试验 5.2.6 供快速检验沙门氏菌的噬菌体简化诊断法 采用如下 3 种噬菌体：沙门氏菌 O-I 噬菌体；E 多价噬菌体，内含 E 和 Sh；C 多价噬菌体，内含 C、 CE 和 Ent。

培养基和试验菌液的准备均同前法 涂抹试验菌液： 斑点涂抹法将琼脂平板表面分为 4 等分或 6 等分， 每等分可供涂抹一株细菌培养物， 每株培养物涂抹 3 个菌斑，外圈 2 个，内圈 1 个棉签涂抹法可将试验菌液在琼脂平板上涂抹成带状， 每个平板约可涂抹 5 条菌带，置数分钟，待菌斑干燥 依次滴加上述 3 种噬菌体斑点涂抹法，一般可把 O-I 噬菌体滴加在内圈的菌斑上带状涂抹法， 可将 O-I 噬菌体滴加在菌带的左边待噬菌体液滴干燥后，翻转平板，在 36 培养 5 h 6 h，和 14 h 24 h 各观察一次结果按表 2 判定结果 表 2 噬菌体试验简化诊断法 O-I E 多价 C 多价 判定结果 CL - - 沙门氏菌属 v CL v 大肠埃希氏菌 - - CL 弗劳地氏柠檬酸杆菌群 a - - - 噬菌体不裂解培养物 注：CL 表示融合性裂解； 表示不裂解；v 表示裂解或不裂解 a除表 1 的注中所述外，并含阴沟肠杆菌和少数大肠埃希氏菌 GB 4789.312013 8 5.3 噬菌体不裂解培养物的补充生化试验 少数沙门氏菌培养物不被 O-I 噬菌体裂解，少数大肠埃希氏菌培养物不被相应噬菌体裂解。