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第3章 同位素示踪技术,中国农业大学 齐孟文,第3章 同位素示踪技术同位素示踪 通过同位素标记核素或同位素标记化合物跟踪研究相关物体运动过程及其规律的一种研究方法§3.1 同位素示踪的基本依据和特点,依据,放射性同位素元素的同位素具有1)化学及生物学性质同一的示踪性 2)物理性质差异的可探测性,稳定性同位素元素的同位素具有1)化学及生物学性质同一的示踪性 2)物理性质差异的可探测性3)同位素的天然组成恒定,在水文、地理及生物学中，相关周期表中的同位素要览点击黄色标注的元素，即可链接到相应网页，可获得关于其特性及应用的简要说明LINK：USGS（ U.S. Geological Survey）,特点,放射性　1.测量灵敏度高 活度检测限Amin=1Bq,相应物质的质量检测限10-12 ～ 10-17g　2.能与内源物质相区分，可在生理稳恒条件进行代谢研究　3.样品制备及测定简便　4.结合显影或显像技术可进行定位定量或半定量测定稳定性 　1.现代质谱核素丰度测定的精度可达0.01%.　2.利用同位素稀释原理可计算样品中的物质来自示踪剂的比率 3.样品制备分析需大型设备　4.无放射性，无衰变，无污染。

有时是唯一的§3.2 标记核素与标记化合物 3.2.1放射性同位素 常用放射性核素,3.2.1放射性同位素标记化合物 化合物分子中某一元素的一个或数个普通核素原子被其放射性同位素核素原子所替代1)标记方式均匀标记［U］ 标记原子在相应位置均匀分布，丰度相同，由生物合成产生不定位标记[G] 标记原子在相应位置丰度不同，由同位素交换法产生定位标记 标记原子在分子中有确定位置，由化学合成产生2)制备有机合成 简单标记化合物复杂标记化物 如：生物合成 饲喂标记前体→生物系统→生物大分子标记化合物生物合成示例,同位素交换 RH+T2 RT+ HT RH+T2O RT+THO 氚标可用所谓的气爆法进行.把底物涂到石英瓶内,抽真空后,充入氚气,通过高频放电或紫外光照射使氚气活化,促进交换.反应结束,抽吸剩余氚气,用易挥发溶剂转移产物,最后除去溶剂.,,,3)特点组成及总量不恒定放射性纯度 所需放射性核素的活度占标记化合物制剂总放射性活度的百分数。

放化纯度 在制剂中，标记核素在特定标记化合物中的活度占该核素总活度的百分数 放化纯度可用放射性薄层分析测定放化纯度说明示例 如碘-131的NaI制剂，除131I-，还可能有131I2， 若放化[I-131]NaI的放化纯度>95%，则表示以其他化学状态存在的碘131<5%辐射自分解 标记化合物的辐射对其自身所产生的离解作用微量和低浓度 操作量为微居里 (10-7-１０-14g )，因浓度低，单独不易沉淀，并易吸附损失，在操作时常需加入同位素载体，以避免吸附或进行共沉淀4)贮藏开瓶分装,降低放射性溶液的浓度，降低比活度低温(2-4℃)及避光保存3.2.2稳定性同位素名词核素的丰度 一种核素在其所属元素的同位素原子中所占的原子百分数核素的自然丰度 核素在自然状态下的丰度核素的原子百分超 核素的丰度较自然丰度超出的部分常用核素 常用的稳定性示踪核素列表,标记化合物 通过富集标记元素的稀有同位素核素或贫化其普通同位素核素所形成的化合物，以及核素的自然丰度因环境而异有较大的同位素分馏变异，带有原位标记“指纹”特点的化合物。

§3.3 试验设计的一般原则和程序,3.3.1放射性同位素示踪示踪剂的选择考虑因素 核素(射线种类、能量和半衰期)，标记方式 例：有机磷农药马拉硫磷残留研究，14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ标记均可，降解中的去甲基作用 (14Ｃ～CH3—)，酯键的水解作用 (14Ｃ，３Ｈ～Ｃ2Ｈ5—)，硫代磷酸脂键的反应，用32P或15Ｓ标记示踪剂量的估算引入量 标记化合物的用量，按一般实验要求确定 放射性总活度或比活度，要求能被精确测量，而又不过强 分无或有内源物示踪两种情况讨论无内源 此种情况下，示踪剂在系统中未被稀释,化合物的比活度不变，示踪剂的比活度可由对样品活度的要求直接估计得到 式中,nmin ～样品的最小计数，最好为2000 -4000cpm;～仪器的计数效率；W ～试样重量；C ～样品中示踪物的含量 若实验期间,放射性有明显衰变,应进行衰变校正举例,无内源物质的示踪试验,如农药残留试验,试样重1克,要求计数率达到2400 cpm,已知仪器的探测效率为80%,若要求对样品的检测灵敏度为0.1ppm,问示踪标记化合物的比活度至少为多少.,有内源 此种情况下，示踪剂在系统中被稀释。

对示踪剂比活度的估计，除要考虑仪器的探测效率和实验期间放射性衰减外，必需考虑稀释作用的影响示踪剂的比活度可由如下两种方法之一估计 估值法 式中，W，C为试样重及物质浓度或含量；Pdff为来自示踪剂的比率倒推法 以盆栽为例，设植株总重M2 ，试样重M1 最低计数率n (n≧4nb本底)考虑：不均匀分布因子P1 试样的平均计数率： 仪器的探测效率 　试样的活度：总样本量M2, 供试植株的总活度：,验期间的衰变　引入时植株的活度： A3＝Ａ2Ｐ2 ，植株的吸收利用率　应引入的活度： 回代得到：,举例,有内源物示踪实验示踪剂引入量的估计以32P标记肥料实验为例，设实验持续100d,测量样品量取1g,植物平均含磷0.4%，其中来自肥料的比里率为Pdff(10%-50%),按25%估算，若样品用固闪杯法测量，仪器的探测效率为80%，要求计数率为2000cpm,试估算32P标记肥料的比活度示踪剂的准备,开瓶分装 对商业制剂进行必要稀释和转化的操作工作程序 1.核查包装说 例 　磷—32标记磷酸氢钠制剂 1)标记化合物名称 Na２Ｈ３２ＰＯ4 2)物理化学状态 溶液，无色透明 3)溶液体积 5 mci/ml 4)比活度 0.5 mci/mmol 5)放射性总活度 2.5 mci 6)放射化学纯度 100% 7)测定日期 2000.3.12 8)包装情况 安培瓶盛装，再置铝罐内。

2.确定稀释倍数浓度稀释关系 S0V0 =S1V1式中，S0、S1和V0、V1分别为稀释前后制剂的放射性浓(μci/ml)，及体积 比活度稀释关系: a0m0=a1(m0+m1)式中，a0、a1分别为标记化合物稀释前后的比活度，m0和m1为标记化合的质量和所加稳定性同位素载体的质量示踪剂的准备,3.开瓶分装操作 采用屏蔽和时间防护等措施，妥善处理废物4.使用前测定活度及放化纯度，必要时应纯化示踪剂的引入植物体 根部 水培、沙培、土培 地上部 涂抹法、注射法、点滴法 动物体 注射法、涂布渗入法、吸入法示踪剂引入系统示例1．Jim Rasmussen, el at, 2007. Soil Biology ＆ Biochemistry 39,804-815.研究目的：套种体系碳、氮的转移、沉积和淋溶动态实验布置：田间微区，插入PVC柱，内径30cm示踪剂：14C-尿素，15N-尿素标记方法：叶缘吸收植物叶片插入到盛有示踪液的小管，小管由布拉膜密封，持续标记5天14C-尿素标记用2ml管,盛1ml标记液，活度7.7×106dpm(3.5Ci); 15N-尿素用5ml管,盛2ml 0.75%(w/v) 丰度为99%的15N-尿素标记液。

在整个生育期14C标记重复3次，15N标记重复5次2. Jessica L.Butler, el at,2004. Soil Biology ＆ Biochemistry 36,371-382.研究目的：新固定的光合作用产物在植物根际的分布与周转实验布置：盆栽示踪剂：13CO2. 标记方法：整株饲喂盆栽植物移入气密的透明有机玻璃光合室进行标记，光合室长×宽×高为40.5×40.5×58.5cm3,每次标记11个盆13CO2在光合室直接发生,标记开始时监测光合室CO2的浓度约为200ppm(v/v)，滴入1.5ml 1.5M乳酸到盛有含22.4mg NaH13CO3(13C丰度为99%),此时光合室CO2的浓度大约升到约600ppm,待CO2的浓度降到200ppm，再在另一个含22.4mgNaH13CO3管中发生13CO2,此时CO2升至400ppm,待其再次降到200ppm，将标记盆移走，放入另一光合室内一段时间，以便使呼出的13CO2被固定，使标记最大化3.Florian wechern, el at, 2007. Soil Biology ＆ Biochemistry 39,2527-2537.研究目的：土壤根源性C和N的沉积及其归宿。

实验：田间小区示踪剂：14C-蔗糖，15N-尿标记方法：茎部饲喂标记溶液1ml浓度2%(w/v),13C丰度为99%的蔗糖和浓度0.5%(w/v)，15N丰度为99%的尿素引入方法,在距根部约3cm的茎处钻0.5mm的洞，用灯芯与盛标记溶液的带盖试管相连，用硅胶密封连接处示踪研究举例,14CO2植物光合生理研究 目的： 测量光合强度，同化物的运转与分配，运转机理，源与库的关系及其调节，研究作物高产的光合生理 1）14CO2标记 (14CO2+12CO2)的发生 反应方程 (HClO4 ,H3PO4) Ba14CO3+Na2CO3 (14CO2+12CO2),,有关计量参量 光合作用二氧化碳的饱浓度为（0.12%-0.18%），一般向光合作用室引入0.1% ～ 0.2%浓度,最高不0.5%,4CO2的放射性浓度(a )：整株标记，5Ci/L；标记单个器官，几百kBq/L；标记大型树木，100 Ci/L 设光合作用室的体积为V(L), 二氧化碳的浓度为C(%),则,所需载体Na2CO3：,,Na2CO3+2 HClO4 CO2+2NaClO4+H2O 106 22.4 X VC 所需Ba14CO3的活度A=Va 发生过程： 在光合作用室内直接发生，或预先在实验室发生，标记时注射法引入。

2）标记过程,光合室 用聚氯乙稀（框或不框）封围供试体，扎紧，保证气密，在袋上封扎进气软胶皮导管 用注射器定量吸取发生好的(14CO2+12CO2）注入光合室，爆光30min后，抽出残气，用NaOH吸收3）测样方法固样 1050C杀青,800C烘干，磨碎.取100mg，低本底计数或固闪杯法测量液样 用碱湿消化或然烧法制样后用液闪测量。