《杂交技术》PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,3.2 杂交技术,3.2.1 探针和探针标记,一、概念,1、探针（(probe）：,带有能检测的标记物的DNA或RNA2、探针标记：,使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交3、杂交：,互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程注意：探针必须经过标记，以便示踪和检测二、标记方法,1、切口平移标记,2、随机引物标记,切口平移法(,nick translation),控制,DNA,酶,浓度，使,DNA,的一条链在有限的位置上大开切口，形成,3 -,OH,和5 -,P,末端,E.,coli,DNA,聚合酶,将核苷酸连接到切口的3羟基末端同时该酶具有从,53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸由于在切去核苷酸的同时又在,切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着,DNA,链,移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，即将一个个带有标记物的,-32 P,dNTP,加在3,-,OH,末端。

最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸切后平移：,DNA,的切口从左到右沿着,DNA,平移的过程,2.随机引物合成法,随机引物：,能与,任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,能在随机引物的引导下以带有标记物的,dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针通常产物平均长度为400-600个核苷酸利用随机引物进行反应的,优点,是：,(1)Klenow片段,没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针2)反应时,对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应3)反应产物的,比活性较高,可达4109 cpm/g探针4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行3.2.2 杂交,blot,一词，有不同翻译，有人叫“,印迹法,”，也有人翻译为“,斑渍法,”，更为普通的是直接称为Southern blot),一、种类,杂交技术有,固相杂交,和,液相杂交,之分固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。

固相支持物常用,硝酸纤维素膜,(nitrocellulose filter membrane，简称,NC膜,)或,尼龙膜,(nylon membrane)固相杂交包括膜上,印迹杂交和原位杂交,前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测二、杂交方法,（一）、斑点印迹(Dot-blot)杂交,将待测核酸样品变性后直接点样在膜上，称之为,斑点印迹,为使核酸牢固结合在膜上，通常还将点样后的膜进行80真空烘烤2h应用斑点印迹技术，可在一张膜上同时进行多个样品的检测，操作简便、快速，在临床诊断中应用较广适合进行特定基因的定性及定量研究，但不能鉴定所测基因的分子量二）、Southern印迹(Southern blot),1、定义：,指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程2、原理：将限制性内切酶对DNA样品进行,酶切处理,，经琼脂糖凝胶,电泳,将所得DNA片段按分子量大小分离，接着对凝胶进行,变性,处理，使双链DNA解离成单链，并将其,转移到NC膜,或其它固相支持物上，转移后各DNA片段的相对位置保持不变。

用,探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交，,可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等3、作用：,Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列4、Southern印迹的操作方法,（1）、毛细管转移(或虹吸印迹)传统方法进行毛细管转移时，DNA片段由液流携带从,凝胶转移到固相支持物表面安放装置时，在转移槽中央的平台上由下到上,依次叠放,变性凝胶、滤膜、一叠干的吸水纸巾；凝胶与转移缓冲液通过滤纸桥连接；,滤膜上的纸巾吸水,产生并维持毛细管作用,，液体由于毛细管作用抽吸通过凝胶，并将DNA片段携带聚集在滤膜上DNA片段的大小和琼脂的浓度决定了转移的速度小片段DNA(1kb)在1小时内可从 0.7琼脂糖凝胶上几乎定量转移，而大片段DNA的转移较慢且效率较低，如大于15kb的 DNA片段需要18小时而转移尚不完全500克总物,玻璃板,吸水纸,尼龙膜,3层滤纸,3层滤纸,滤纸,（2）、电转移利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，可达到简单、迅速、高效的目的。

一般2-3小时内可转移完毕3）、真空印迹法,这是近年来发展起来的一种简单、快速、高效的DNA和RNA印迹法其基本原理是利用真空作用将转膜缓冲液从凝胶上层的容器抽到下层，凝胶中的核酸片段将随缓冲液移置到凝胶下面的固相支持物上30分钟至1小时可完成注意：,Southern印迹后的滤膜仍需进行固定处理，对NC膜可用80真空烘烤2小时，对尼龙膜还可用短波紫外线(波长254nm)照射几分钟4、Southern印迹的操作过程,酶切,DNA,，,电泳,分离，使,DNA,原位变性将,DNA,片段,转移到固体支持物(,NC,膜),上预杂交,滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点让探针与同源,DNA,片段杂交,然后,漂洗除去非特异性结合的探针,（,用放射性检测仪探测放射强度,）洗完的膜用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，且保鲜膜与,NC,膜之间,不能有气泡,将膜正面向上，放入暗盒中，在暗室的红光下，贴覆两张,X,光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置,-70,低温冰箱中曝光,根据信号强弱决定曝光时间，一般在,1-3,天时间洗片时，先洗一张,X,光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子M P C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,P C 1 2 3 4 5 6 7 8,PCR-Southern,检测,部分转BT基因抗性愈伤组织的,Southern,杂交检测,M 1 2 3 4 5 6 7 8,由于放射形同位素对人体危害很大，,故也常常用DIG,标记,（三）Northern印迹(Northern blot),1、定义、,Northern印迹是指将RNA片段变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。

RNA样品经Northern印迹后进行杂交反应可鉴定其中特异 mRNA分子的量与大小2、Northern印迹的方法,Southern印迹基本相同但RNA不能用碱变性，因为碱会导致RNA水解因此，在Northern印迹前，须进行RNA变性电泳，在电泳过程中使RNA解离形成单链（消除二级结构）分布在凝胶上，再进行印迹转移3、RNA变性电泳的方法,用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链Northern 杂交和 Southern 杂交主要区别在于：,Northern 杂交中待测的物质是,RNA,Southern 杂交中待测的物质是,DNA,C 1 2 3 4 5 6 7 8,rRNA,Northern,杂交检测,（四）、Western杂交,1、定义、,是将蛋白质先经电泳（,SDS,PAGE,胶,）分离，然后转移到固相载体上，最后用特异性抗体进行免疫测定或蛋白质的染色Western 印迹法又称蛋白质印迹技术，它是70年代末，80年代初发展起来的一种蛋白质检测新技术其基本过程,2、原理,与,Southern,或,Northern,杂交方法类似，但,Western Blot,采用的是,聚丙烯酰胺凝胶电泳,，,被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过,PAGE,分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变以固相载体上的蛋白质或多肽作为,抗原,，与对应的抗体起,免疫反应，,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。