最新同工酶实验宁波大学幻灯片.ppt

同工酶实验宁波大学同工酶实验宁波大学实验目的实验目的：理解同工酶的概念及遗传学意义理解同工酶的概念及遗传学意义学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色样品制备样品制备取材：　大黄鱼若干条，解剖取取材：　大黄鱼若干条，解剖取1.肠、肠、2.眼睛、眼睛、3.鳃、鳃、4.肌肉、肌肉、5.脾、脾、6.鳍、鳍、7.肝、肝、8.心脏　放入冰箱保存心脏　放入冰箱保存提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需４此溶液需４℃℃预冷，组织重量（预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（）与缓冲液体积（mL）之）之比为１：比为１：5,用研钵研磨充分浆液４用研钵研磨充分浆液４℃℃离心约３０分钟，１离心约３０分钟，１５０００转／分钟５０００转／分钟取上清液至新管，吸取其中取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加１００样品，加１００ul 甘油甘油和１０和１０ul溴酚蓝，混匀之后即可点样溴酚蓝，混匀之后即可点样。

分离胶的制备分离胶的制备 将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使烧杯，按表比例混匀之后使用储备液储备液A储备液储备液C储备液储备液E储备液储备液双蒸水双蒸水TEMED总体积总体积用量用量（（ml））2.53.750.113.7510ul20配方表配方表浓缩胶的制备浓缩胶的制备•TEMED最后一个加入，轻轻混匀移液枪吸取加入约最后一个加入，轻轻混匀移液枪吸取加入约2.0CM左右高度左右高度的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡当浓缩胶上出现水的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成再放置层后表明聚合完成再放置30－－60min后可以使用后可以使用•加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓冲液备用冲液备用储备液储备液B储备储备液液D储备储备液液E储备液储备液F储备液储备液双蒸水双蒸水TEMED总体积总体积用量用量（（ml））1.250.860ul 52.916ul10配方表配方表点样点样加样加样样品迁样品迁移方向移方向电电 泳泳Ø电压和电流：浓缩胶电压电压和电流：浓缩胶电压100v，分离胶电压，分离胶电压180V. 电电流流流流18－－30mAØ溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。

大约溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束大约2-3个小时个小时夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的样品加在槽中的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳示意图电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子乳酸脱氢酶染色剂的配制乳酸脱氢酶染色剂的配制乳酸钠乳酸钠 0.5mlNAD 25mgPMS 2mgNBT 15mg0. 2M Tris－－Hcl溶液（溶液（PH8.0））10ml去离子水定容至去离子水定容至50ml染色与观察染色与观察将胶从中间切成将胶从中间切成2块，各自切去一个小块，各自切去一个小角（作为标记），去离子水轻轻从玻角（作为标记），去离子水轻轻从玻璃板上吹下，璃板上吹下，置于大培养皿中，去离子水浸洗之后置于大培养皿中，去离子水浸洗之后倒入染倒入染染色剂浸没，避光于染色剂浸没，避光于37度摇床中染色度摇床中染色30min。

观察拍照观察拍照思考题：思考题：根据实验过程的体会，总结如何做好根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？哪些过程中是关键步骤？哪些过程中是为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？甘油溶液？分别有何用途？谢谢。