微丝染色及形态观察PPT课件.ppt

[ [目的要求目的要求] ]1. 掌握微丝的染色方法2. 了解光镜下微丝的基本形态结构3. 了解细胞松弛素B对微丝的作用及原理 微丝染色及形态观察微丝染色及形态观察[ [实验原理实验原理] ] 真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管、微丝和中间纤维微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用微丝由蛋白单体聚合形成，细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状细胞松弛素B对微丝的作用具有可逆性 当细胞用TritonX-100溶液处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组成的应力纤维 应力纤维由平行排列的微丝组成，体外培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长  微微丝丝在在细细胞胞内内的的分分布布特特征征[实验用品实验用品]n器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。

n材料：盖玻片培养的成纤维细胞n试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1％TritonX-100溶液、M-缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮蓝染液、100μg /ml的细胞松弛素B、DMEM培养液 [实验步骤实验步骤]1. 培培养养 在在成成纤纤维维细细胞胞进进行行传传代代培培养养时时，，将将已已消消毒毒的的盖盖玻玻片片涂涂上上多多聚聚赖赖氨氨酸酸，，放放入入培培养养皿皿中中，，于于37℃℃、、5%CO2的温箱中生长的温箱中生长24h～～48h （设正常生长组和细胞松弛素（设正常生长组和细胞松弛素B处理组）处理组）2. 染色处理染色处理（（1））取取材材 取取出出铺铺有有细细胞胞的的盖盖玻玻片片，，放放入入小小培培养养皿皿中中（（正正面面向向上上））,用用PBS洗洗3次次（（从从盖盖玻玻片片一一角角轻轻轻轻滴滴加加3   4滴），洗去表面的培养液滴），洗去表面的培养液2））抽抽提提 吸吸弃弃PBS，，加加入入1% Triton X-100液液4-5滴滴（（刚刚好好覆覆盖盖盖盖玻玻片片表表面面）），，室室温温处处理理25 ～～30min（或置（或置37℃℃18min）。

（（3）稳定）稳定 吸弃吸弃Triton X-100，立即用，立即用M-缓冲液轻缓冲液轻 轻地洗涤轻地洗涤3次，每次次，每次3min4）固定）固定 略晾干，在略晾干，在3%戊二醛液中固定戊二醛液中固定10min，， 再以再以PBS液洗液洗3次，洗去固定液次，洗去固定液5））染染色色 滴滴加加3-5滴滴0.2%考考马马斯斯亮亮兰兰染染液液染染色色20   30min，然后小心的用自来水漂洗然后小心的用自来水漂洗6）观察）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水留取少量水分封片于载玻片，吸水 纸吸去多余的水光镜下观察临时装片纸吸去多余的水光镜下观察临时装片[实验结果实验结果]n光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松弛素丝沿突起规则排列；用细胞松弛素B B处理的标本，处理的标本，由于微丝被破坏、突起缩回多数细胞形状变圆；由于微丝被破坏、突起缩回多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正用，肌动蛋白重新聚合成微丝，细胞形状恢复正常。

常n1 1．光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的应力纤．光镜下观察被染成蓝色的微丝聚集成的应力纤维束（注意成纤维细胞中微丝分布的特点）维束（注意成纤维细胞中微丝分布的特点）n2 2．注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤．注意观察正常对照片与用药处理后的标本成纤维细胞形状的区别维细胞形状的区别n3 3．观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是．观察用药处理后又洗去药的标本中细胞形态是否恢复正常否恢复正常 光学显微镜下微丝分布图光学显微镜下微丝分布图 [注意事项注意事项]n1. 1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去n2. 2. 恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理恢复时间要足够，否则细胞不会恢复到未处理 前的状态前的状态n3 3．操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面．操作中应注意区分细胞盖玻片的正反面n4 4．染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞．染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤细胞n5 5．．TritonX-100TritonX-100抽提蛋白时，注意避免抽提时间过抽提蛋白时，注意避免抽提时间过 长而导致细胞结构的破坏。

长而导致细胞结构的破坏[作业与思考题作业与思考题]n1 1．比较三种不同情况下细胞中微丝的分布特点？．比较三种不同情况下细胞中微丝的分布特点？n2 2．实验中设计对照组的作用及重要性？．实验中设计对照组的作用及重要性？n3 3．．TritonX-100TritonX-100液、液、M-M-缓冲液、戊二醛及考马斯缓冲液、戊二醛及考马斯 亮蓝在本实验中所起作用？亮蓝在本实验中所起作用？。