结核分支杆菌耐药基因的杂交检测.doc

1结核分支杆菌耐药基因的杂交检测【摘要】 目的 采用 PCR-反向斑点杂交检测结核分支杆菌中 rpoB基因、KatG 基因和 rpsL 基因突变评价该方法检测结核分支杆菌利福平(RFP)、异烟肼(INH)和链霉素耐药性，探讨直接检测结核患者痰标本的可行性方法 用 PCR-反向斑点杂交技术分析对 75 株临床分离株和 45 例肺结核患者涂阳痰标本进行 rpoB、rpsL 和KatG 基因突变的检测结果 临床耐药株分离株进行 rpoB、rpsL和 KatG 基因突变的检测，其突变率分别为83．9％、 62．5％、 57．1％肺结核患者涂阳痰标本中耐药株突变率分别为 81．0％、60．0 ％、52．9％结论 rpoB 基因、KatG 基因和 rpsL 基因突变与结核分支杆菌耐利福平、异烟肼和链霉素密切相关，应用 PCR-反向斑点杂交技术可快速检测结核分支杆菌对异烟肼、链霉素和利福平耐药性PCR-反向斑点杂交技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一  【关键词】结核分支杆菌；反向斑点杂交；药物耐受性 近年来全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药(DR-TB)和耐多药 (MDR-TB)结核病的广泛分布和迅速传播。

异烟肼(INH)、链霉素(SM)、利福平（RFP ）作为结核病治疗中最主要的一线抗结核药物，对其耐药性的研究日益受到重视传统的结核分支杆菌耐药性测定由于需要 6～8 周时间，不能及时指导临床用药2近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对结核菌的耐药机制有了进一步认识，认为结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶－过氧化物酶的编码基因 KatG 基因的缺失和突变有关，也 inhA 基因突变也有相关性；耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白 S12 编码基因 rpsL 和 16SrRNA 的编码基因 rrs 的缺失和突变所导致；结核分支杆菌耐 RFP 与其核心区域 rpoB 基因突变有关[1 、2]笔者采用采用 PCR－反向斑点杂交技术分别对肺结核患者痰标本临床分离株和结核患者痰标本直接进行 KatG 基因、rpsL 基因、rpoB 基因的突变检测，现将结果报告如下  1 资料与方法  1．1 标本来源 75 株临床分离株和 45 例肺结核患者涂阳痰标本均来自吉林市结核病防治研究所，其中 31 例耐 RFP，28 例耐INH，24 例耐 SM 45 例肺结核患者涂阳痰标本按结核病诊断细菌学规程进行菌种鉴定及药敏实验证实为结核分支杆菌，其中 21例耐 RFP， 17 例耐 INH，20 例耐 SM。

  1．2 细菌 DNA 的制备[3] 临床分离株 DNA 用常规酚／氯仿抽提法提取标本中 DNA  1．3 PCR 扩增 采用 25 ul 反应体系， 4×dNTPs 终浓度为0．2 mmol／L ，Bio-标记引物终浓度为 0．2 umol／L，扩增程序为：94℃变性 I min，58℃退火 1 min，72℃ 延伸 I min，循环 30次，最后 72℃延伸 10 min扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳紫外检测出现 267 bp 条带  31．4 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素膜装入杂交袋中，加入杂交液放置水浴锅中进行预杂交：45℃×30 min将 Bio-标记引物的 PCR 扩增阳性产物变性：95 ℃×l0 min，取出迅速放入冰盒中，每 ml 杂交液一般加 l0ul 变性的扩增产物，放置水浴锅中进行杂交：45℃×30 min洗膜：洗液 1 、45℃× 3 min，洗液 2 、45℃×3 minSA-AP：用 l：1000 的稀释液(洗液 I)与膜在 37℃作用 30 min洗膜：洗液 I、45℃× 3 min，洗液 II 、45℃×3 min显色：每毫升洗液 I 加入 NBT 6．6ul 、BICP 3．3ul 混匀，将配好的显色液加入杂交袋中，闭光 37℃显色 5 min，观察结果  2 结果  应用 PCR-反相斑点杂交技术检测 rpoB、rpsL 和 KatG 基因突变结果（见表 1、 2） 。

75 株临床分离株进行 rpoB、rpsL 和KatG 基因突变的检测，PCR 扩增均为阳性，其耐药株突变率分别为 83．9 ％、 62．5％、 57．1％，其敏感株突变率分别为0、0 、2 ． 1％45 例肺结核患者涂阳痰标本进行 rpoB、rpsL 和KatG 基因突变的检测，其耐药株突变率分别为81．0％、 60．0％、 52．9％, 其敏感株突变率分别为0、4 ．1%、3．7％  3 讨论  目前，结核分支杆菌耐药性测定仍多采用绝对浓度法、比例法等经典方法但由于结核分支杆菌生长缓慢，而耐药结核分支杆4菌生长更为缓慢，其耐药性测定需 6～8 周甚至更长，不能及时指导临床用药Bactec 结核培养系统因其价格昂贵等诸多不便限制了其广泛使用近年来，随着分子生物学的不断发展已研究发现结核分支杆菌耐 RFP 与其核心区域 rpoB 基因突变有关，结核分支杆菌耐异烟肼的产生是过氧化氢酶－过氧化物酶的编码基因 KatG 基因的缺失和突变有关，也 inhA 基因突变也有相关性；耐链霉素的产生是由于其核糖体蛋白 S12 编码基因 rpsL 和 16SrRNA 的编码基因rrs 的缺失和突变所导致。

  本实验室前期通过 PCR-SSCP 方法得出耐异烟肼时，KatG基因突变率为 63．1% ，耐链霉素时，rpsL 基因突变率为72．2%，耐利福平时， rpoB 基因突变率为 90．1%[3] 但 PCR-SSCP 方法建立在凝胶电泳基础上，难于标准化和质量控制，难以大规模推广通过对 KatG、inhA、rpsL、 rrs 基因核心易变区进行DNA 序列分析根据基因突变的中心区域，设计靶基因，制备寡核苷酸探针，点样在杂交膜上，进行 PCR－寡核苷酸探针反相斑点杂交  PCR-反相斑点杂交检测临床分离株 rpoB、rpsL 和 KatG 基因突变，耐药株的 rpoB、rpsL 和 KatG 基因突变率分别为83．9％、 62．5％、 57．1％，这与一些报道相近[4] 还有 2．1%的敏感株 KatG 基因发生突变，原因有待于进一步探讨PCR －反向斑点杂交技术直接检测了 54 例肺结核患者痰标本，耐药株突变率分别为 81．0％、60．0 ％、52．9％突变率略低于其临床分离株5这可能是由于痰标本杂质多，同时痰标本的处理和靶 DNA 浓度对PCR 扩增有直接影响PCR －反向斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏并可以直接检测未经培养的痰标本中结核分支杆菌 rpoB、rpsL和 KatG 基因突变，可在 2 d 内出结果，从而弥补了常规药敏实验的不足，有望成为临床耐药性测定的重要手段之一。

  参考文献 ［1］ Williams D, Waguespack C, et al. Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria. Antimicrob Agents Chemother, 1994, 38: 2380-2386.  ［2］ Morris S, Bai GH, et al .Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis ,JID,1995,171:805.  ［3］ 张永胜，李书琳，张小刚，等.结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究.中国医师杂志， 2002，4(4) ：374-375.  ［4］ 庄玉辉，何秀云，张小刚，等.耐利福平结核分支杆菌耐药分子机制的研究. 中华结核和呼吸杂志，2000，23：711-714.。