甾体激素类药物的分析4.ppt

第十章 甾体激素类药物的分析Analysis of steroid hormones 激素（Hormone，荷尔蒙）是人体内各种内分泌腺所分泌的一种生物活性物质激素作用于特定的称为靶器官的组织、细胞上而发挥作用如果激素分泌出现平衡失调，可使人体发生病变，如甲亢、糖尿病等ABCD1 23 456789 10111213141516171819Ø 基本结构概 述甾体激素类药物均具有环戊烷骈多氢菲母核Ø 分类甾体激素肾上腺皮质激素性激素雄性激素孕激素雌激素蛋白同化激素（一）肾上腺皮质激素△4–3–酮基（紫外吸收）天然皮质激素：氢化可的松Ø 母核有21个碳原子C17–醇酮基 （还原性）醋酸地塞米松结构修饰曲安息龙地塞米松磷酸钠提高结构稳定性增强抗炎作用（二）雄性激素和蛋白同化激素Ø 天然雄性激素：睾酮△4–3–酮基4位引入卤素或19位去 甲基或将A环结构改造 均明显降低雄性作用， 增加蛋白同化作用Ø 母核有19个碳原子Ø A环中有△4–3–酮基结构结构修饰增加脂溶性，制成油注射剂可口服、延效丙酸睾酮甲睾酮 增加位阻，难代谢氧化 ，稳定性增强可口服蛋白同化激素苯丙酸诺龙4-氯醋酸睾丸素Ø 母核有18或19个碳原子（三）孕激素C17--甲酮基△4–3–酮 基天然孕激素：黄体酮Ø 母核有21个碳原子Ø 口服被迅速破坏失效， 只能肌注结构修饰醋酸甲地孕酮（孕酮类孕激素）炔诺孕酮（睾酮类孕激素）炔诺酮（睾酮类孕激素）口服、长效口服、长效，17-OH作成庚酸 酯，注射一次可维持3个月（四）雌激素 天然的雌性激素：雌二醇Ø 母核有18个碳原子Ø A环为苯环，C3位上有酚 羟基，C17位上有β-羟基结构不稳定，口服无效结构修饰 炔雌醇 戊酸雌二醇 苯甲酸雌二醇乙炔基引入，使 仲醇变叔醇，增 加空间位阻，阻 碍酶对药物的氧 化代谢，可口服17位羟基酯化， 酯在体内缓慢水 解，延效3位羟基酯化， 酯在体内缓慢 水解，延效可口服 高效 长效人工合成代用品：非甾体化合物己烯雌二酚高效、长效△4–3–酮C17–α–醇酮 基C17–β– 羟基C17–甲酮基A环为3– OH苯环 肾上腺皮质 激素++雄性与蛋白 同化激素++雌性激素++孕激素++鉴别反应UV、羰 基试剂、 氨基脲反 应还原性（碱 性酒石酸酮 、氨制 AgNO3）可成酯与亚硝基铁氰 化钠、间二硝 基苯反应UV、与 重氮苯磺 酸盐反应二、特殊官能团与分析方法第二节 鉴别试验一、物理常数的测定二、化学鉴别法三、制备衍生物测定熔点四、紫外分光光度法 五、红外分光光度 六、薄层色谱法 七、高效液相色谱法第二节 鉴别试验二、化学鉴别法（一）呈色反应（1）与强酸的呈色反应强酸： H2SO4、H3PO4、HClO4、HCl原理：酮基先质子化，形成正碳离子，再与 HSO4-作用呈色。

显 色荧光加水稀释氢化可的松棕黄色至红色 绿色黄色至橙黄色炔雌醇橙红黄绿玫红絮状↓炔雌醚橙红黄绿红色↓泼尼松黄→橙—黄色渐变蓝绿色泼尼松龙深红—灰色絮状↓地塞米松淡红棕色—颜色消失苯甲酸雌二醇黄绿色蓝色淡橙色与硫酸显色反应1、C3–酮基和C20–酮基（1）与羰基试剂2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯 肼反应生成腙2)官能团的呈色反应（2）与羟胺或氨基脲分别生成具有一定熔点的肟 或缩氨脲HCl黄色3，20-双腙室温下长 时间加热结论： 成腙反应中Ø C20–酮基受C18甲基的 空间位阻影响，反应较 慢，需加热或较长时间 放置，才完成反应Ø C11–酮基受C18、C19位甲基 甲基的阻碍，不发生反应Ø C3–酮基空间位阻最小 ，最易起反应，室温下先 生成单腙2、C17–α–醇酮基的呈色反应（还原性）Ø 能与碱性酒石酸铜试液（斐林试液）、氨制 AgNO3试液（多伦试液）、四氮唑盐反应呈色 其中以四氮唑盐的显色反应最为常用，不但可 用作层析法的显色剂，还可用于含量测定.Ø 适用：肾上腺皮质激素＋ 2Cu2+ + 4OH-+ Cu2O + H2O橙红色＋ 2Ag+ + 2OH-+2Ag + CH3COOH黑色醋酸去氧皮质酮+H2O+ CH3COOH++ OH-醋酸泼尼松深红色的三苯甲鐕四氮唑盐结论：Ø 三苯甲鐕于490nm处显示最大吸收，可用比色 法测含量。

Ø 四氮唑盐反应还用于肾上腺皮质激素类药物 中杂质“有关物质”检查的显色剂Ø 反应在碱性条件下（水解）进行Ø 适用：具有甲酮基或活泼亚甲基的甾体激素类药物3.甲酮基的呈色反应Ø 能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反 应呈色孕激素（1）甲酮基：☻黄体酮专属性反应黄体酮其他甾体亚硝基铁氰化钠蓝紫色 淡橙色或不显色结论：Ø 在碱性条件下进行Ø 与亚硝基铁氰化钠反应称为碱性硝普钠反应2）亚甲基的反应：硫酸普拉睾酮乙醇 间二硝基苯氢氧化钠紫红色Ø 适用：雌激素类药物4.酚羟基的呈色反应Ø 能与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮 染料苯甲酸雌二醇H++红色有机氟Fˉ有机破坏有机氯5、卤元素的呈色反应茜素氟蓝—硝酸亚铈硝酸—硝酸银呈蓝紫色 ClˉAgCl氯原子结合 在母核环上6、沉淀反应（1）与碱性酒石酸铜（斐林试液）的沉淀反应（2）氨制AgNO3（多伦试液）的沉淀反应（3）与AgNO3的沉淀反应Ø 适用：含炔基的甾体激素类药物（炔雌醇、炔诺酮）Ø 机理：↓HNO3++NaOH滴定，电 位法指示终点（4）与HNO3-AgNO3的沉淀反应Ø 适用：甾体激素类药物C21位上有氯原子取代，如丙酸 氯倍他索。

Ø 机理：有机氯原子水解 加热无机氯原子结合在母核 环上的氯原子氧瓶燃烧法破坏无机氯原子硝酸—硝酸银AgClØ 原理：一些甾体激素类药物具有醋酸酯、戊酸 酯及已酸酯的结构，可先行水解，根据水解产物 来鉴别7、水解产物的反应Ø 适用： 本类药物C3、C17或C21位上羟基的酯Ø 结果：醋酸酯水解后生成的醋酸可与乙醇反应，生成 有香气醋酸乙酯戊酸或己酸酯类水解后可生成有特臭的戊酸或 己酸，进行鉴别三、制备衍生物测熔点（二）酯的水解醇制KOH水解m.p.为150℃~ 156℃（一）酯的生成+ KOH丙酸睾丸素睾丸素m.p.为201℃+m.p.约182℃（分解）（三）缩氨基脲的生成苯丙酸诺龙苯丙酸诺龙缩氨脲H2NCONHNH2（四）酮肟的生成炔诺酮HONH2炔诺酮肟 m.p.约195℃（分解）醋酸泼尼松△４-3-酮（五）UV-ViS分光光度法240nm左右280nm左右苯环其他共轭结构原 理200-760nm有特征吸收方 法可规定最大吸收波长、A、吸收系数、A大/A小示 例曲安息龙曲安息龙丙酸倍氯米松丙酸倍氯米松溶剂溶剂甲醇甲醇乙醇乙醇浓度浓度20μg/ml20μg/ml20μg/ml20μg/ml结果判断结果判断在在238nm238nm处处 有最大吸收有最大吸收在在239nm239nm处有最大吸收，处有最大吸收，A A为为 0.570.57～～0.600.60，在，在239nm239nm与与263nm 263nm 处的吸收度比值为处的吸收度比值为2.252.25～～2.452.45结构特征：酚羟基C17 –OHC17 –乙炔基eg1:炔雌醇（六）IR法原料药1505cm-13505cm-13300cm-1ν1590cm-1 3610cm-1酚羟基醇羟基1615cm-1苯环的骨架振动eg2：黄体酮△４-3-酮结构特征：C17-酮基1700cm-1C=O20位酮基1665cm-13位酮基1615cm-1870cm-1 C-H双键七、TLC法八、HPLC应用甾体激素类药物原料与 制剂的鉴别甾体激素类药物原料与制剂 的鉴别（如：醋酸曲安奈德 软膏、醋酸氟轻松软膏）方法对照品法对照品法结果 判断要求供试品溶液所显主 斑点的颜色和位置与对 照品溶液的主斑点相同要求在含量测定项下记录的 色谱图中，供试品峰的tR与 对照品峰的tR一致第三节 特殊杂质检查Ø 杂质来源：原料、中间体、异构体、降解产物以及 试剂和溶剂。

一、有关物质的检查Ø 其他甾体：有些杂质与该甾体激素药物结构类似 ，也具有一定的药理作用而又互不相同，因此在甾体 激素类药物的质量控制中，“其他甾体”的限度检查显 得很重要Ø 检查方法：（具有一定分离能力）u 判定方法：规定杂质斑点数目规定杂质斑点颜色1、TLC法（自身对照法）eg：氢化可的松中其他甾体的检查供试液：本品+氯仿-甲醇（9：1） 浓度：3.0mg/ml对照液：供试液（3.0mg/ml）+氯仿-甲醇（9：1） 60μg/ml 层析：供试液 对照液 点样、展开、斑点检出判断：供试液如显杂质斑点，不得多于3个，其颜色与对照液的主斑点比较，不得更深2、HPLC法（自身对照法）≤图A中峰1面积的四分之三u 判定方法： 规定杂质峰数目规定杂质峰面积二、游离磷酸盐的检查Ø 方法：对照品比色法Ø 杂质来源：地塞米松磷酸钠生产过程中，由磷酸酯 化时残存的过量磷酸盐ØØ 结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于对照溶液的 吸光度740nm740nmØØ 原理：供试液原理：供试液+ +钼酸铵钼酸铵+1-+1-氨基氨基-2--2-萘酚萘酚-4--4-磺酸磺酸 钼蓝钼蓝三、有机溶剂残留量的检查eg：地塞米松磷酸钠ØØ 方法：方法：GCGC色谱法色谱法Ø 杂质来源：地塞米松磷酸钠生产中，使用大量 甲醇和丙酮。

ØØ 结果判断：不得出现结果判断：不得出现甲醇峰，甲醇含量≤0.3％丙酮规定不得过≤5.0%四、硒的检查氧瓶燃烧二氨基萘比色法测定Ø 杂质来源：地塞米松、氟轻松和曲安奈得等甾体激 素类药物，在生产中使用二氧化硒(SeO2)脱氢工艺， 药物可能引入杂质硒ØØ 方法：方法：药物ØØ 结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液结果判断：供试品溶液的吸光度不得大于硒对照溶液 的吸光度的吸光度（0.005％～0.01％） 378nm378nm五、雌酮 六、乙炔基第四节 含量测定常用方法容量法比色法紫外分光光度法荧光法气相色谱法 高效液相色谱四氮唑盐比色法异烟肼比色法铁-酚试剂比色法一、HPLC法USP、BP、JP均采用Ø 方法：RP－HPLC（内标法）ØØ 测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂测定对象：甾体激素类药物的原料和制剂egeg：黄体酮的含量测定：黄体酮的含量测定 色谱条件：固定相色谱条件：固定相 ODSODS，检测波长，检测波长254nm254nm流动相流动相 甲醇甲醇- -水（水（65:3565:35））内标物内标物 己烯雌酚己烯雌酚系统适用性试验：系统适用性试验：n>1000n>1000，，R R符合规定。

符合规定测定样品：黄体酮原料、注射液测定样品：黄体酮原料、注射液 定量方法：内标法定量方法：内标法 内标内标-1-1二、UV-ViS分光光度法1、△４-3-酮 240nm（±）2、苯环 280nm（±） 雌激素肾上腺皮质激素 雄性激素和蛋白同化激素 孕激素（一）UV分光光度法缺点：专属性不强示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查示例：醋酸地塞米松片的含量均匀度检查 （（1 1）配制供试液，取）配制供试液，取1010片分别进行测定片分别进行测定 （（2 2）测定：）测定：2。