
hiv病毒扩增.doc
3页HIV病毒扩增1.目的本作业指导书规定了HIV-1复制的实验程序和相应操作2.适用范围适用于BSL-3实验室中HIV-1的复制3.职责BSL-3实验室内实验操作人员严格按照要求执行4.作业程序4.1 样本采集、送检和保存抗凝外周血全血,抗凝剂使用ACD、CPD、肝素或EDTA血量要求:成人或儿童至少10~20ml,婴幼儿1~2ml全血样品必须在离体8h以内处理,样品处理之前需室温保存4.2 设备和材料4.2.1 生物安全柜(生物安全二级)4.2.2 37℃及56℃水浴箱4.2.3 离心机(转速可达1500g;需要有水平转头及O-环密封罩)4.2.4 普通光学显微镜 4.2.5 CO2孵箱(37 ± 1℃,恒湿,5% CO2)4.2.6 10-100ul 100-1000ul加样器及配套无菌Tip头4.2.7 细胞计数板4.2.8 T-25细胞培养瓶4.2.9 15及50ml离心管4.2.10 10ml移液管4.2.11 冻存管4.2.12细胞冻存盒4.3试剂4.3.1 磷酸盐缓冲液(PBS)或Hank’s平衡液(HBSS):无钙镁离子;室温保存注意生产厂商注明的有效期;或者启用1周后废弃。
4.3.2 淋巴细胞分离液(Ficoll分离液)4.3.3 青霉素和链霉素4.3.4 胎牛血清(FBS)4.3.5 RPMI 1640培养液4.3.6 人重组白细胞介素2(rIL-2)4.3.7 台盼兰染液4.3.8 植物血凝素(PHA)4.3.9 聚凝胺(polybrene)4.3.10二甲基亚砜(DMSO)4.4 实验准备4.4.1 RPMI 1640完全培养液:含10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素使用前,须预热至37度4.4.2 聚凝胺(pb):使用终浓度为2ug/ml4.4.3 人重组白细胞介素-2(rIL-2):使用终浓度为20U/ml4.4.4 植物血凝素(PHA):使用终浓度为3 ug/ml4.4.5 准备废物罐,废液缸等物品4.4.6 登记样品编号4.5 实验操作4.5.1 HIV阴性血PBMC的准备4.5.1.1 将HIV阴性液转移到50ml或15ml离心管中,400g,24°C,离心10 min4.5.1.2 吸取血浆并分装冻存4.5.1.3 用PBS将剩余血液稀释到原体积的2倍4.5.1.4 在一新的50或15ml离心管中加入1倍体积的淋巴细胞分离液,将已混匀的2倍体积的稀释血液缓慢地加在淋巴细胞分离液上,400g,24°C,离心30 min。
4.5.1.5 吸弃上层的PBS(保留的部分PBS距离PBMC层约0.5 cm)4.5.1.6 用移液管吸取PBMC层,转移到50或15ml离心管4.5.1.7 加入3倍体积的PBS混匀,400g,24°C,离心10min4.5.1.8吸弃上清,加入10 ml PBS混匀细胞团,400g,24°C,离心10min4.5.1.9吸弃上清,加入10ml含20U/ml rIL-2的1640完全培养液混匀细胞吸取20ul 细胞悬液用于细胞计数4.5.1.10调整细胞浓度至3×106/ml,加入PHA至终浓度3μg/ml4.5.1.11放入37°C细胞培养箱,常规培养3d4.5.2 HIV感染者PBMC的准备采集HIV感染者血液样本后,按4.5.1.1至4.5.1.12的操作步骤分离PBMC4.5.3 病毒复制的实验操作步骤4.5.3.1取10×106经PHA刺激培养3d后的健康人PBMC,用1640培养液混匀(终浓度3×106细胞/ml),加入pb(终浓度2ug/ml ),37℃,5%CO2放置30分钟,每15分钟摇匀一次4.5.3.2 1500rpm离心10分钟,弃上清4.5.3.3 将HIV病毒上清从液氮中取出,37度水浴中迅速融化。
4.5.3.4用1ml病毒上清重悬经pb处理后的PBMC细胞团4.5.3.5 37℃ 5%CO2培养2h,每30分钟轻摇离心管,使细胞重悬4.5.3.6 2h后,加入10ml 1640完全培养液混匀,1500rpm离心10分钟,弃上清重复此步骤三次4.5.3.7用含IL-2的1640完全培养液重悬细胞团,使细胞浓度为3×106/ml4.5.3.8 转入T25细胞培养瓶内,37℃ 5%CO2培养至少14天4.5.3.9第3或4天,吸取少量上清液用于p24抗原检测若p24足够高,一般>2ng/ml,可吸取半量上清液,并补充60×106新鲜的正常人PBMC(PHA刺激3d),维持细胞终浓度为3×106 /ml;否则,可进行半量换液,补充等量新鲜培养液,继续培养4.5.3.10第7天,吸取少量上清液用于p24抗原检测若p24>2ng/ml,可吸取半量上清液,并补充60×106新鲜的正常人PBMC(PHA刺激3d),维持细胞终浓度为3×106 /ml;否则,可进行半量换液,并补充6×106新鲜的正常人PBMC和新鲜培养液,使细胞终浓度为3×106 /ml,继续培养4.5.3.11第10天,同第3天。
4.5.3.12第14天,检测上清p24抗原含量,若p24>2ng/ml,收集全部培养上清,3000rpm离心20分钟,吸取上清于液氮冻存,完成病毒复制;若p24<2ng/ml,则弃去培养上清和细胞,并作无害化处理4.5.4 HIV-1病毒上清冻存4.5.4.1 将P24抗原检测符合标准的PBMC共培养上清分装到1ml的冻存管内,直接置于-80℃冰箱,需要长期保存(3个月以上)须将病毒转入-196℃液氮保存;4.5.4.2 用FBS配制10%DMSO冻存液,将共培养PBMC以1*107cell/ml浓度分装冻存管内,放入专用冻存盒内,-80℃冰箱过夜保存,12h内转入-196℃4.6说明: 除了PBMC共培养外,也可以选用HIV感染者的全血、血浆/血清与靶细胞PBMC共培养建立感染1) 全血共培养:将感染者5~100μl抗凝全血与活化的HIV阴性者PBMC混合培养,总体积2ml2) 血浆/血清共培养:将患者的血浆或血清标本与活化的HIV阴性者PBMC混合培养其余操作流程与PBMC共培养法相同。
