常用作物生理指标测定方法.doc

SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液可溶性蛋白用同一提取液磷酸缓冲液配制：A 液（Na2HPO4 0.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或 Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB 液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或 NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到 1000ml浓度 mol/lPH 值A 液体积 mlB 液体积 ml定容体积 ml0.057.891.58.54000.17.584162000.17.061392000.16.012.387.72001/157.06139300130mmol/l 甲硫氨酸（Met）溶液：称 1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至 100ml0.75mmol/l 氮蓝四唑（NBT）溶液：称 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml 避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取 0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至 1000ml0.02mmol/l 核黄素溶液：取 0.00753g 核黄素定容至 1000ml 避光保存反应液组成 水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml 反应液的组成是水 12.7ml+磷酸（0.05M,PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25mlSOD：：称取 0.5g 鲜样，加 1ml 磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8） ，冰浴研磨，研磨后再加入 1ml 缓冲液倒入离心管，再用 2ml 缓冲液冲洗研钵，倒入离心管中，平衡后低温（0-4℃）10000rpm 离心后 10min 冷藏保存。

取相同型号的试管，加入 20μl 上清液（2 支对照管加缓冲液） ，分别加 3ml 反应液，其中一支对照放于暗处，其余在 4000lux 下反应 20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再 560nm 下进行比色计算公式：SOD 总活性（units.g-1FW）=(Ack-A)*V/Ack*0.5*W*a(V 酶液总体积 4ml，w 样品重=0.5g，a 测定是的酶液体积=0.02ml)POD：：取上清液 20μl 加入比色杯中（对照加磷酸） ，加 3ml 反应液，马上读 470nm 下的 OD 值并计时，每个 1min 读 1 次（读 0，1，2，3min）的 OD 值反应液：0.1mol/L，PH=6.0 的磷酸 50ml,加入愈创木酚 28μl，于磁力搅拌器加热溶解，加入 30%的H2O219μl 存于冰箱内计算公式：POD 总活性（△OD470/Min.gFW）=△OD470*V/a*W(V=4ml,a=0.02ml,W=0.5g)CAT：：取上清液 100μl 加入比色杯中（对照加磷酸） ，加 3ml 反应液，马上读 240nm 下的 OD 值并计时，每个 1min 再读一次（读第 0，1min 的 OD 值） 。

反应液：0.1mol/L PH=7.0 磷酸缓冲液 20ml，加入 0.1mol/LH2O2(5.68ml30%H2O2定容至 1000ml)5ml计算公式：CAT 总活性（△OD240/Min.gFW）=△OD240*V/a*W(V=4ml,a=0.1ml,W=0.5g)数值下降MDA: 取上清液 1ml(对照加 1ml 水） ，加 2mlTBA（硫代巴比妥酸） ，封口沸水浴 15min，迅速冷却（用冷水冲泡） ，倒入指形管中，4000 转下离心 20min,取上清液于 600nm,532nm,450nm 下比色0.67%TBA：称 0.67gTBA 加少量 1mol/LNAOH 溶解，再用 10%三氯乙酸定容 100mlMDA(μg/gFW)=C*V/W=0.1548(D532-D600)+0.013D450(V=0.012L,W=0.5g)可溶性蛋白：可溶性蛋白：取上清液 20μl（对照加水） ，加 3ml 考马斯亮蓝放置 2min，立即于 595nm 比色G-250：称取 100mgG-250 溶于 50ml90%乙醇中，加入 85%（v/v）磷酸 100ml，定容至 1000ml，常温可保存一个月。

计算公式：蛋白质含量（mg/gFW）=3*Y*V/5*1000*a*W标准曲线 Y=143.15OD+3.6（生理组）或 Y=143.56OD+1.28（园艺系）V 酶液总体积=4ml,a=0.02ml,W=0.5g，3/5 由于标线是 5ml 中的含量，而本方法用 3ml，1000 将 μg变为 mg)可滴定酸：可滴定酸：1.取一彩椒，称重，放入高速组织捣碎机内，加入等量水，捣碎 1～2min每 2g 匀浆折算为 1g 试样2.称取 25-50g，用无 CO2 水 100ml，洗入 250ml 容量瓶，在 80 度水浴中 30min，取出冷却，用无CO2 水定容过滤3.取滤液 50ml 或 100ml 加入三角瓶中加酚酞 5-10d，用 NaOH 标液滴定，呈微红色，当滴定接近终点时，若溶液仍呈橙黄色，可再加 2d 酚酞，CK 空白滴定记下所消耗的体积结果计算（1）试样的可滴定酸度以每 100g 或 100mL 中氢离子毫摩尔数表示，按下式计算：可滴定酸度[mmol/100g(mL)]=[（c×V1）/V0]×[250/m(V)]×100式中：c——氢氧化钠标准溶液摩尔浓度V1——滴定时所消耗的氢氧化钠标准溶液体积(mL)V0——吸取滴定用的样液体积(mL)m(V)——试样质量(g)或体积(mL)250——试样浸提后定容体积(mL)（2）试样的可滴定酸度以某种酸的百分含量表示，按下式计算：可滴定酸度（%）＝[(c×V1×k)/V0]×[250/m(V)]×100式中：k——换算为某种酸克数的系数， 0.1Mol/LNaOH 标液：50gNaOH 加入 500ml 蒸馏水，溶解贮于塑料瓶中，吸取 5.4ml 加入 1000ml容量瓶中，用刚煮沸冷却的蒸馏水稀释至刻度。

0.5%酚酞：0.5g 酚酞加入 100ml90%乙醇本试验用水应是不含二氧化碳的或中性蒸馏水,可在使用前将蒸馏水煮沸、放冷,或加入酚酞指示剂用 0.1mol/L 氢氧化钠溶液中和至出现微红色植物组织中游离氨基酸总量的测定：（茚三酮溶液显色法）植物组织中游离氨基酸总量的测定：（茚三酮溶液显色法）水合茚三酮试剂：称取 0.6g 再结晶的茚三酮置烧杯中，加入 15ml 正丙醇，搅拌使其溶解再加入30ml 正丁醇及 60ml 乙二醇，最后加入 9mlPH5.4 的乙酸-乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶中，置4℃下保存备用，10d 内有效乙酸-乙酸钠缓冲液（PH5.4）：称取乙酸钠 54.4g 加入 100ml 无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸，使体积蒸发至 60ml 左右冷却后转入 100ml 容量瓶中加 30ml 冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100ml标准氨基酸：称取 80℃下烘干的亮氨酸 46.8mg，溶于少量 10%异丙醇中，用 10%异丙醇定容至100ml取此液 5ml，用蒸馏水稀释至 50ml，即为含 5μg/ml 氨基酸之标准液0.1%抗坏血酸：称取 50mg 抗坏血酸，溶于 50ml 无氨蒸馏水中，随配随用。

1.样品制备：取干样，混匀后，迅速称取 0.05-0.1g,于研钵中加入 5ml10%乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至 100ml混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用2.制作标准曲线：取 6 支 20ml 刻度试管，按下表操作：试剂123456标准氨基酸/ml00.20.40.60.81.0无氨蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.0水合茚三酮/ml3.03.03.03.03.03.0抗坏血酸/ml0.10.10.10.10.10.1每管含氮量/ml012345加完试剂后混匀，盖上大小适中的玻璃球，置沸水中加热 15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用 60%乙醇定容至 20ml混匀后再 570nm 下测定吸光度3.样品测定：吸取样品滤液 1.0ml，放入 20ml 干燥试管中，加无氨蒸馏水 1.0ml，向每管中加入3.0ml 水合茚三酮，0.1ml 抗坏血酸加完试剂后混匀，封口，置沸水中加热 15min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热形成的红色被逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色，用 60%乙醇定容至 20ml混匀后再 570nm 下测吸光度。

根据标准曲线查得含氮量计算公式：100g 样品中氨基态氮含量=（C*Vt/Vs*W）*100 (C 为从标准曲线查得的氨基态氮含量，μg；Vt 为样品稀释总体积，ml; Vs 为测定时样品体积，ml；W 为样品干重，g)注意：（1）因为茚三酮与氨基酸反应所生成的 Ruhemans 自在 1h 内摆出稳定，故稀释后尽快比色；（2）严格掌握加入抗坏血酸的量；（3）在 80℃水浴中加热，应该适当延长反应时间，效果良好可溶性糖：可溶性糖：0.3g 鲜样品（或 0.03g 干样）加入 10ml 蒸馏水，封口沸水浴 30min（2 次）,滤纸漏斗过滤入 50ml 容量瓶中，冲洗残渣，定容吸提取液 1ml 加入蒸馏水 1ml（对照加 2ml 蒸馏水） ，加蒽酮乙酸乙酯 0.5ml，加浓硫酸 5ml，振荡，沸水浴 1min，自然冷却后与 630nm 下比色计算公式：可溶性糖（%）=100*Y*V/(a*n*W*106）(Y 由 Y 糖(μg)=322.58OD-0.96774 查得 V 提取液体积=50ml a 测定时吸取的体积=1ml n 为稀释倍数 W 鲜样品重=0.3)叶绿素测定：叶绿素测定：取新鲜叶片，擦净表面污物，去掉中脉，用打孔器取叶圆片，混匀，称取叶圆片0.2g，加 20ml 80%的丙酮（80ml 丙酮定容于 100ml） ，封口，置于暗处 24-36h，到叶片变白，于663nm,646nm,470nm 下比色（对照是 80%丙酮） 。

公式：Ca(mg/L)=12.21D663-2.81D646Cb=20.13D646-5.03D663Cx.c=(1000D470-3.27Ca-104Cb)/229叶绿体色素含量（mg/gFW）=C*V*n/W(V=0.02L,n=1,W=0.2g)根系根系 TTC 活力：活力：根系去掉根尖和上部老根，取根 0.4-0.5g,剪成 2cm 长的段，放入试管中，对照先加入 1mol/LH2SO4,其余试管中加入 0.4%TTC 和磷酸缓冲液（1/15mol/L,PH=7.0）等体积混合液10ml，封口，放入 37℃恒温箱 4h，取出，除对照外其余加 1mol/L H2SO42ml 中止反应，放置15min 后取出根，吸干，再放回原试管，各试管中加入 10ml 95%乙醇，封口，提取 24h 至根变白，根据颜色稀释 3-5 倍后，于 485nm 下比色40 个样用量：0.4%TTC 称 1gTTC，溶于 250ml 蒸馏水中1/15mol/L PH=7.0 取 A=61ml+B 液=39ml 稀释到 300ml1mol/L H2SO4: 先在烧杯中加入 100ml 水，再加入浓硫酸 11ml，冷却后定容200ml。

计算公式：四氮唑还原强度（μg/gFW.h）=(OD+0.0035)/4*h*W*0.0022 (h=4 W=0.4-0.5g)茎粗(为第一叶痕茎基部的粗度，用游标卡尺测量，每处理随机取 5 株，取其平均数); 测定方法 茎粗为用游标卡尺测量地上部第三节间的直径分 3 次对茎粗进行观测(5-6 片叶之间)株高(茎基部到生长点的长度，卷尺测量，每处理测 5 次，取其平均数);节间长度(为最终一次采收时，测分枝以上五个节间的长度之和除以 5)辣椒：叶面积、冠幅、株高测定。