定量分析技术.ppt

定量分析技术,组织学与胚胎学教研室杜 娟,☛形态计量☛细胞化学计量术,形态计量,,任何组织结构都是具有一定形状和空间分布的几何物体，对于其形态学描述包括两个方面：一、定性描述：二、定量描述：该结构的体积、表面积、长度、数目等形态计量是对结构形态的定量描述从几何学的角度，形态计量学主要分为:平面计量学和体视学平面计量学用于估计二维平面上的结构的定量特征体视学则以结构的切片获得的二维测量值,如径长、周长、面积等，依据几何统计学的方法，推导出结构的三维参数，如表面积、体积等三维空间结构的几何特征与其切面的几何特征之间必然有一定的联系：一定体积的结构（细胞）→一定面积的平面轮廓一定面积的结构（小肠绒毛表面）→具一定长度的边线一定长度的线性结构（毛细血管） →具一定数目的截点,体视学（stereology）的任务就是在二维平面图像上，根据二维图像与三维结构的数学关系，从截面面积推导空间体积；从截线长度推导空间曲面的面积；从截点数目推导空间曲线的长度、数目等定量测量图像的基本工具是测格它画或印在透明材料上，是包含有点和（或）线面的几何图案应用时，将之叠加或叠映于图像上，然后记录其与图像间的关系安装在显微镜目镜内的测格称目镜测格，是将测格图案印于一小块透明玻璃上，或摄制于一小块透明胶片上，并将之置于目镜光阑处，使测格的图案清晰地叠映在显微镜内观察的组织图像上。

应用目镜测格可直接在显微镜内观察和测量图像 目镜测格与测微台尺组成目镜测微器依据几何图案的不同，测格可分为若干种，常用的有：●网状方格●关联短线测格●平行等距直线测格,网状方格,最常用的测格测格中部是小正方格，四周是半个小方格，四角是四分之一小方格纵横直线是测试线，测试线的交点是测试点图中共有100个测试点若其中方格的边长为d， 那么网状方格内的测线总长度为200d测线总面积为100d2，则每一测点所占有的测线长度和测面面积分别为： 2d和d2●关联短线测格●平行等距直线测格,基本的测量步骤有三：1．获得要测量的组织图像；2．在图像上叠加或叠映测试格，然后进行点记数测试；3．将测试结果带入相应的公式，进行数学运算后即得估计结果测量的方法可概括为三类：1．点计数；2．特征物计数；3．长度测量,1．点计数（1）测点计数计数图像的测点数2）交叉点计数估计测线与所测图像的周界线之间形成的交点数目面积,在一个或一组平面轮廓上随即叠加一组规则排列的测点（test point），测点的分布范围大于待测轮廓的分布范围位于轮廓内的测点总数Ｐ，乘以每一测点所关联或相当的面积α，即为待测轮廓的总面积Ａ　　　　　Ａ＝Ｐ× α这种体视学测试方法即：测点计数。

计数待测轮廓边线与纵横测线的交点，带入测量公式： L =π/4 PdL为曲线长，P为交叉点数目，d为小方格边长边线长度,根据体视学原理,每个测点所关联或相当的面积为d2,每个测点所关联的测线长为2d边线密度,待侧轮廓边线的总长除以包含待侧轮廓的参照面总面积，即：单位面积参照面内待侧轮廓边线的长度2．特征物记数：（1）轮廓面计数计数一定测试区域内的轮廓面的数目当轮廓面与计数区域有交叉时，计数轮廓面有二种方法：禁线法则与相关点计数禁线法则（forbidden-line rule）：事先将计数框的某一边向某一方向延伸，规定好禁线（测试框的左边、下边、左边向上的延伸线和（或）右边向下的延伸线）及计数线（测试框右边和（或）上边），只计数完全在测试框内的以及只与计数线有交叉的轮廓，而不计数与禁线有任何交叉的轮廓相关点计数 事先给每个轮廓面指定一个或多个独特的点，即相关点，轮廓面的计数转变为点计数 若给每个轮廓面指定了m个相关点，若在某一区域内计数了n个相关点，那么，该测试区内的轮廓面的数目为n/m2）粒子计数 如溶酶体、突触、细胞核、卵泡、肾小球、胰岛的计数。

需要利用体视框，即需要利用至少两个通过离子的连续截面无偏估计粒子数：体视框（disector）●物理体视框●光学体视框,物理体视框,用多张切片来实现的体视框15张肾脏连续切片，每张5μm，在第13张切片上随即叠加一测试框，以第3张切片为对照平面在测试框平面观察肾小球平面并计数，然后在对照平面上观察在测试框平面和对照平面上形成切面的肾小球不计数，只在测试框平面形成切面的才计数　　如此计数肾小球犹如在一个底面为测试框，高为5０μm的长方体空间内计数，这个长方体空间即为一个物理体视框　　肾小球的数密度＝肾小球总数／所用体视框总体积,用体视框估计离子数的基本要求：体视框的高应小于待测离子的直径，最好不超过离子直径的1/3光学体视框,只采用一张厚切片，在厚切片内连续观察光学切片（可用普通光镜的油镜或激光共聚焦显微镜来进行），并计数粒子来实现的体视框是估计小离子（细胞核、核仁）的数密度的最佳工具3．长度测量（1）费莱特直径测量（2）宽度测量（3）截距测量（4）点取截距测量,（1）费莱特直径测量费莱特直径是指某一方向的，与轮廓面两端相切的两条平行线之间的距离一轮廓面的平均费莱特直径，常以两个相互垂直的随机方向上的费莱特直径的平均值或以最大和最小费莱特直径的平均值估计。

费莱特直径,细胞化学计量术,细胞化学计量术（quantitation in cytochemistry）是用数字语言描述细胞内某种化学物质或其反应产物（包括组化和免疫组化）的量的方法包括细胞图像光度术（image cytometry, ICM）和非成像细胞计量术（non-image cytometry, n-ICM）细胞图像光度术以显微成像设备为基础，以光学原理为依据，测定组织切片内单个细胞切面或涂片中单个细胞图像的光度，以评估单个完整细胞及其群体的化学物质的含量以不同的光学原理形成的细胞图像，采用显微吸收光度术或显微荧光光度术等不同方法进行测量显微吸收光度术检测组织或细胞吸收照射光的程度，以此为基础计量组织、细胞的某化学物质的含量　　组织或细胞吸收照射光约多，细胞图像色彩越深，其化学物质含量越高其结果用吸光度（又称光密度）表示显微荧光光度术组织、细胞发出的荧光越强，色彩越鲜艳，单位组织、细胞体积内的化学物质含量越多目前，应用于细胞图像光度术（ICM）的主要仪器有：显微分光光度计、显微图像分析仪、激光共聚焦扫描显微镜等显微分光光度计(microspectrophotometry)又称细胞分光光度计，是一种以物质分子对光波的选择性吸收为基础，在显微镜下对生物样品细微结构中的化学物质进行定量测定的方法，具有吸收光测量、荧光和荧光光谱分析等多种定性和定量功能。

可精确测定细胞化学或荧光染色标本中单个细胞、单个核及核仁内的核酸、酶和其它物质含量基本原理显微分光光度计与化学分光光度计原理相同，样品厚度恒定，吸光度与样品浓度成正比细胞内蛋白质、核酸、多糖、脂类等在不同等电点下可电离出不同基团，应用不同试剂，可显现出不同的颜色反应，可对细胞内的大分子物质进行定量测定结构构成仪器的几个主要组件包括:1.显微镜: 聚光器要求消色差、消球差2.光源: 钨丝灯,氙灯,汞灯3.单色仪和滤光片：4.光电组合件:测栏,光电倍增管,放大器,计算机系统显微图像分析仪图像分析系统(Image analysis system)，是光学、电子学和计算机技术相结合的产物，能从各种图像中，获取几何的或光密度的数据，精确表达标本中的各种信息为生命科学许多领域的研究提供了定性和定量分析的优越手段和精确数值，有利于确定形态与功能之间的量化关系，有助于更好地揭示生命活动的内在联系和疾病的变化规律显微图像分析系统的主要组件：１．显微镜２．计算机３．图像采集装置：CCD摄像机、图像采集卡等CCD摄像机采集模拟的显微图像，经图像采集卡转换成数字图像，以供计算机的图像处理与分析软件对其进行处理与分析。

４．图像处理与分析软件,激光扫描共聚焦显微术(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)是利用激光扫描进行“光学切片”，利用显微镜进行微观检测，利用计算机对数据资料进行存贮和分析的一门高新技术能把形态学的定量观察、生理学的动态检测和生物化学的定量分析成功地融合为一体，具有高灵敏度和可观察空间结构的独特优点可进行细胞断层扫描，对被检物体达到立体和动态的全面观察与记录基本原理激光扫描共聚焦显微镜以激光为光源，激光通过光源针孔聚焦到达样品的某一深度，形成一个光点，其反射光经共聚焦后通过检测针孔成像，不受成像平面以外的反射光和散射光干扰，极大地提高共聚焦显微镜的分辨率原理：►激光散射少►入射光源针孔与检测针孔的位置相对于物镜焦平面共轭,样品可经过机械的台阶调节和激光聚焦镜的调节，调节激光聚焦的深度（200-400m)，进行全方位的立体扫描，即光学切片将扫描信息输入计算机，可获得任何切面的平面图和三维的立体图像特点1．分辨率高 观察的是样品一个焦平面的图像，最小观察厚度为0.5㎛,是普通光学显微镜的1.4倍2．灵敏度高 不同的滤片可将不同的荧光分开，极弱的荧光也可检测到。

3．扫描速度快，可进行动态检测 可动态观察细胞内钙、镁离子和pH变化，对膜电位和膜流动性进行检测4．光学切片与细胞CT通过调整聚焦点，可得到样品不同深度的图像，经计算机进行三维重组，可获得“细胞CT”的所有数据5．图像存取方便 图像处理和定量荧光分析，经计算机保存，数据存取方便，可随时调用图像特点：高分辨率，高清晰度,细胞图像光度术的优点：●在显微镜下较好保持待测组织和细胞的形态特征、比邻关系；●可以分析极小体积和极少比例待检测细胞的组织细胞图像光度术的缺点：检测速度慢细胞图像光度术的应用：广泛用于细胞和组织化学物质含量的测定非成像细胞计量术以悬液或不透明固像物为组织、细胞的载体，使用不同的仪器检测悬液或该固像物内非成像的单个细胞或组织、细胞群体的光度或放射线强度，以表述单个细胞或单位细胞群体的某化学物质含量优点：快速对单个细胞或组织、细胞群体的化学成分的含量进行检测，获得大量有统计学意义的检测数据；在检测单一种类细胞（细胞系）或具有特征标记的细胞的化学物质的含量具有独到的优越性　　缺点：不能直观区分不同特征形态的细胞种类，影响检测结果的客观性主要仪器：流式细胞仪、酶标仪、液闪记数仪等。

其中，流式细胞术是应用最广泛的技术之一流式细胞术(flow cytometry, FCM)是流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机综合技术产品，又称荧光激活细胞分类器可对单个细胞进行快速分类和定量，每秒可测定上万个细胞，能同时测得DNA、RNA和细胞体积3个参数，可测定细胞核与细胞质的比例，对活细胞分类纯度可达90%以上流式细胞仪主要组件：　　液流系统（鞘液、细胞悬液、流动室）　　激发光器件　　信号检测系统　　控制系统,原理被检细胞制成用荧光染色的单细胞悬浮液，单细胞液柱由流动室喷出，细胞受激光照射后发生散射光和荧光检测器接受聚焦后的荧光信号，可收集2种以上不同波长的荧光信号，可检测细胞体积，细胞DNA和RNA的含量，检测细胞膜表面或细胞内荧光分子数量带正电荷细胞落入左方收集器，带负电荷细胞落入右方收集器，不带电荷细胞落入中央容器，实现细胞分选目的。