荧光光度法测定维生素B.docx

实验、荧光光度法测定维生素 B92一、 实验目的1. 掌握荧光光度分析的基本原理2.掌握荧光光度计的基本结构及操作技术3.了解荧光光度计的应用二、 实验原理某些物质经紫外光照射能发出比原激发光的频率低，波长长的 可见光，这种光称为荧光各种物质经紫外光激发后能发出的荧光 特性与物质的化学性质有关在激发光强度和所通过的溶液厚度不 变时，在一定浓度范围内该物质所产生的荧光强度可用下式表示： b5E2RGbCAPIF=2.3 K' k bcI0 当 I0 一定时， IF=Kc式中K’取决于荧光效率，」是荧光分子的摩尔吸光系数，b是 液槽厚度，c是荧光物质的浓度由此可见光在一定条件下，荧光 强度与物质的浓度呈线性关系用已知浓度的标准与待测样品同样 操作，通过测定荧光强度＜F），按前述的标准曲线法和标准对照 法，求得待测物质的浓度p1EanqFDPw维生素B2,又叫核黄素，是橘黄色无臭的针状结晶维生素B2 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定DXDiTa9E3d维生素B2水溶液在470nm或紫外光照射下会发生绿色荧光，荧 光峰在520nm，在pH 5〜7的溶液中荧光强度最大，在pH 11的碱 性溶液中荧光消失。

多维葡萄糖中含有维生素Bl, B2, C, D2及葡 萄糖均不干扰维生素B2的测定由于维生素B2在碱性溶液中经光 线照射，会发生光分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧 光强的多因此，测量维生素B2的荧光时，溶液要控制在酸性范围 内，且须在避光条件下进行RTCrpUDGiT三、 仪器和试剂1. 荧光分光光度计2. 40p g/mL维生素B2标准溶液：准确称取10.0mg维生素B2，用 热蒸馏水溶解后，转入250mL棕色容量瓶中，冷却后加蒸馏水至标 线，摇匀，置于暗处保存5PCzVD7HxA四、 实验步骤1. 激发光谱的测定及最佳激发波长的选择固定检测〈发射）波长520nm，用400 - 500 nm的光激发，找 出最佳激发波长2. 荧光光谱曲线的测定于50mL容量瓶中，加入40p g/mL维生素B2标准溶液 2.00mL，加水至标线，摇匀在荧光分光光度计上，用1cm荧光比 色皿，激发波长470nm，发射波长为480 - 580nm范围内，测量溶 液的荧光强度，并绘制荧光光谱曲线jLBHrnAILg3. 标准曲线的绘制于6只50mL容量瓶中，分别加入40〃g/mL维生素B2标准溶液 0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、5.00mL，加水至标线，摇匀。

在 荧光分光光度计上，用1cm荧光比色皿于激发波长440nm，发射波 长520nm处，测量标准系列溶液的荧光强度，并绘制标准（工作＞曲 线xHAQX74J0X4. 未知维生素B2溶液的分析五、数据处理以相对荧光强度为纵坐标，荧光发射波长为横坐标绘制荧光光 谱曲线以相对荧光强度为纵坐标，维生素B2的质量为横坐标绘制各标 准曲线未知溶液的分析五、实验数据处理＜一）维生素B2的激发光谱图 ＜固定发射波长为520nm，用400- 500nm的光激发）由图知，维生素B2的最佳激发波长约为450nm，以改波长作为之后荧光光谱的激发波长；＜二）荧光光谱曲线的绘制荧光光谱测定的实验条件如下：Instrument: RF-5301SpectrumType: EMScan Range: 480.0nm to 580.0nmEX Wavelength:450.0nmLDAYtRyKfESample Pitch: 1.0Slit Width: EX:3.0nmEM:5.0nmScan Speed: SuperSensitivity: HighResponse Time:Auto Shutter: Manual, Open以下荧光光谱曲线为浓度为1.6以g/mL的维生素B2溶液的曲线荧光光谱曲线510 520 530 540 550 560 570 58。

波长/nm〈三）标准曲线的绘制选定波长为520nm，有1-5号溶液的浓度与荧光强度如下表12345浓 度0.40.81.21.62.0/ug/mL荧光强度221.433429.134602.881834.8721016.057绘制出标准曲线如下:标准曲线浓度/ug/mLY 二 498.75X + 22.38 0.9985o o o O o o o O2 0 8 61 1发光强度由曲线可求得，在实验条件下，维生素B2的荧光强度与浓度的关系的方程式为，I=498.75c+22.38〈四）未知维生素B2溶液的分析实验测得未知维生素B2溶液在上述实验条件下的，在520nm处的荧光强度为446.839；代入第＜三）步求得的方程式I=498.75c+22.38，可求得未知维生素B2 溶液的浓度为 0.85ug/mLZzz6ZB2Ltk申明:所有资料为本人收集整理，仅限个人学习使用，勿做商业用途。