超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激.doc

第×期 张峰等：超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激素类药物 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定饲料中九种雄性激素类药物张 峰1 许成保1,2 蓝 芳3 王秀娟1 雍 炜1 锁 然2 储晓刚1* 丁 菲1,4 吕泉福1,5 1（中国检验检疫科学研究院，北京100123）2（河北农业大学食品科技学院，保定 071000）3（深圳出入境检验检疫局，深圳 518033）4（浙江中医药大学药学院，杭州310053）5（西南大学药学院，重庆 400715）摘 要 建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）分析动物饲料中违禁添加的去氢睾酮(BOL)、表睾酮(epiAn)、氟甲睾酮(FT)、去氢甲睾酮(美雄酮)(MD)、甲睾酮(MT)、丙酸诺龙(NP)、诺龙(N)、丙酸睾酮(TP)和睾酮(T)9种药物的分析方法样品经乙酸乙酯振荡提取，再用基质固相萃取方法净化处理后，采用UPLC-Q-TOF-MS分析检测在电喷雾正离子模式和飞行时间模式下，输入各化合物的精确分子离子质量数得到相应的提取离子色谱图，以色谱峰面积进行定量分析。

通过碰撞诱导解离模式（CID）得到各化合物碎片离子的精确质荷比，进一步对各化合物进行定性分析各化合物的质量精确度均小于5 ppm，9种化合物在0 ~ 1000 μg/L 范围内均呈良好的线性关系，线性系数均大于0.99除诺龙和去氢甲睾酮外，本方法对各药物的检出限（LOD）均低于6 μg/L；去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮(美雄酮)、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮的定量限（LOQ）分别为16﹑10、20、43、20﹑12﹑15﹑10g和16 μg/kg3个添加水平（LOQ、2LOQ、4LOQ）的回收实验表明，化合物的回收率在70.0%～99.7%范围内，相对标准偏差(RSD)均小于10%本方法的定性准确度明显高于文献报道的方法，可用于饲料中的禁用雄性激素药物的定性确证和定量测定关键词 液相色谱-四极杆-飞行时间质谱；饲料；雄性激素1 引 言雄性激素是一类生物体内产生的调节机体代谢或生理功能的物质，在养殖业中用于促进动物生长、提高蛋白转化率，以达到大幅度提高动物养殖经济效益的目的研究表明，雄性激素药物可通过饲料进入到动物组织，被人体摄入后，残留的雄性激素会干扰人体内自然激素的平衡，引起妇女出现类似早孕的反应以及乳房肿胀、不规则出血等，影响肝脏功能，导致新生儿畸形，并且使人体患癌症的几率大大提高。

因此，欧盟95/22/EC 规定禁止在饲料中使用雄性激素药物，我国也颁布了相关的法律，禁止在饲料中使用雄性激素药物，但是违规使用的案例仍时有出现，所以发展一种快速、准确的检测方法显得很有必要常用的雄性激素的检测方法包括酶联免疫分析法（ELISA）[1]、气相色谱法(GC)[2,3]、气相色谱质谱法（GC-MS）[4~6]、液相色谱法(HPLC)[7]、液相色谱质谱法(LC-MS)[8,9]和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）[10,11]等ELISA、GC和HPLC的方法灵敏度较低, 选择性和特异性较差, 已经不适于雄性激素痕量残留分析的要求GC-MS、LC-MS和LC-MS/MS虽然方法灵敏度和特异性都比较高, 但是，由于难以完全阐明化合物的结构裂解信息，定性准确度方面尚有欠缺，容易产生假阳性的结果四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)技术可对化合物进行精确分子质量的测定，并依据所测得的化合物的精确分子质量对其进行确证分析，同时在碰撞诱导解离（CID）模式下，得到化合物及其碎片离子的分子式和精确分子质量，可进一步对化合物的结构和裂解规律加以确证，定性准确性很高目前，尚未有应用Q-TOF分析雄性激素的文献报道。

本研究采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术，建立了动物饲料中雄性激素的精确分析方法优化了前处理方法和色谱质谱条件，建立了动物饲料中去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮(美雄酮)、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮共9种违禁添加的雄性激素定性确证方法和定量测定方法9种雄性激素的结构式如下：氟甲睾酮（Fluoxymesterone）去氢甲睾酮（Metandienone）诺龙（Nandrolone）去氢睾酮（Boldenone） 丙酸诺龙（Nandrolone 17-propionate）表睾酮（Epiandrosterone）睾酮（Testosterone）甲睾酮（Methyltestosterone）丙酸睾酮（Testosterone propionate）2 实验部分2.1 仪器与试剂ACQUIT Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪, Synapt Q/TOF四极杆/飞行时间质谱仪(Waters公司)；均质器；超声器；振荡器；离心机；旋转蒸发仪甲醇、乙酸乙酯（HPLC级, Fisher科技公司）；甲酸（纯度49%~51%）；N-丙基乙二胺吸附剂（PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18-封端，粒径范围为40~60 μm，100 Å平均孔径）（博纳艾杰尔科技有限公司）；无水MgSO4（分析纯）500 ℃灼烧4 h，置于干燥器中备用；9种雄性激素(去氢睾酮、表睾酮、氟甲睾酮、去氢甲睾酮、甲睾酮、丙酸诺龙、诺龙、丙酸睾酮和睾酮)标准品均购于Sigma公司；实验用水均为超纯水(Millipore公司)。

2.2 样品前处理称取饲料试样2 g (精确到0.01 g)，置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL水，高速均质1 min，水浴超声5 min，取出样品静置，使其温度降至室温加入15 mL乙酸乙酯，水平振荡提取10 min，于5℃，10000 r/min条件下离心5 min收集上清液于另一个50 mL具塞离心管中在剩余混合物中分两次分别加入15和10 mL乙酸乙酯，重复振荡、提取和离心，合并3次上清液于离心管中，从中移取10 mL至另一个25 mL离心管，待净化准确称取400 mg PSA、50 mg C18和600 mg无水MgSO4，一次性加入装有10 mL样品提取液的离心管中，迅速高速涡旋1 min，于5 ℃，10000 r/min条件下离心5 min吸取所有有机相溶液，转移至旋转蒸发瓶中，40 ℃减压蒸发至近干加入2.0 mL 20%(V/V)甲醇溶解浓缩物，涡旋混合1 min，过0.22 µm滤膜，供超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定2.3 色谱-质谱条件Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱( 100 mm ×1 mm i. d., 1.7 μm )；柱温：30 ℃；样品室温度4 ℃；进样体积5 μL。

流动相A为甲醇, B为0.1% (V/V)甲酸, 梯度洗脱：0～5.0 min，70%～95% A；5.0～5.2 min，95% A；5.2～5.5 min，95%～70% A；5.5～6.0 min，70% A流速为0.25 mL/min电喷雾离子源（ESI）：正离子模式；毛细管电压3 kV；锥孔电压35 V；萃取锥孔电压4 V；脱溶剂气温度350 ℃；离子源温度100 ℃；脱溶剂气流速350 L/h；锥孔气流速20 L/h；四极杆采集质量数范围 50~1000 U数据采集模式：棒状（Centroid）；扫描采集时间0.5 s；TOF运行模式：V 模式 参比溶液：200 pg/μL亮氨酸脑啡肽（LE）；采集时间1 s；采集间隔时间10 s；扫描精确质量数554.2615（负离子模式）3 结果与讨论3.1 色谱条件的优化由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态，因此流动相的组成和添加剂除了影响分析物的保留时间和峰形外，还会影响到分析物的离子化效率，从而影响到目标化合物的检测灵敏度本实验分别采用甲醇-0.1%甲酸，乙腈-0.1%甲酸作为流动相，考察流动相组成对于各化合物响应值的影响结果表明，以甲醇-0.1%甲酸作为流动相时，仪器响应值高于乙腈-0.1%甲酸为流动相时的响应值，并且可以获得更好的峰形和分离效果，因此以甲醇-0.1%甲酸作为本实验的流动相，图1为100 μg/L的9种雄性激素类药物的饲料样品的提取离子色谱图。

去氢睾酮（Boldenone）氟甲睾酮（Fluoxymesterone）诺龙（Nandrolone）去氢甲睾酮（Metandienone）甲睾酮（Methyltestosterone）睾酮（Testosterone）表睾酮（Epiandrosterone）丙酸诺龙（Nandrolone 17-propionate）丙酸睾酮（Testosterone propionate） t/min 图1 饲料提取液中九种浓度各为100 μg/L的雄性激素类药物的提取离子色谱图Fig 1 Extracted ion chromatograms of 9 androgens for each compound in feeds extraction（100 μg/L）3.2 质谱条件的优化通过对单个分析物标准品溶液进行一级质谱扫描，确定各目标分析物的准分子离子峰，并分别优化其锥孔电压，通过MassLynx 软件中Elemental Composition功能的分析得到目标分析物的精确分子量，并且可以得到元素组成分析和目标分析物的质量精确度。

根据分析物自身分子式和电喷雾正离子模式加H的机理，选择与目标分子式相匹配的元素组成，并且质量精确度范围绝对值均小于5×10–6，则所测得的质量数为该目标分析物的 [M+H] 精确分子量在实际实验中，在质量精确度绝对值小于5 ppm以内，均可对该化合物进行准确定性分析分别以其准分子离子为母离子，通过氩气碰撞产生碎片离子进行二级质谱扫描，同时优化碰撞能量，选择丰度较高的2种碎片离子作为定性与定量特征离子，最大程度提高检测的灵敏度表1为各化合物的精确分子量，理论分子量和质量精确度，这3种化合物的质量精确度绝对值在0.9～3.8 ppm之间表2为各化合物的特征离子及其优化的质谱参数经过分析，每种药物都得到一个准分子离子和两个特征离子的精确质量数，可以更为精确的定性根据欧盟2002/657/EC的规定，每个高分辨离子可以得到2分，因此，本方法的定性准确度很高，可得到高达6分的判定与一般LC-MS/MS方法的4分相比，有较大提升，可以有效避免采用LC-MS/MS等方法造成的假阳性等结果表1 各化合物的保留时间，精确分子量，理论分子量和质量精确度Table 1 Retention times and accurate mass measurements of molecular ions of target compounds in a standard solution编号NO.化 合 物Compound保留时间RetentionTime (min)元素组成ElementalComposition精确分子量ExperimentalMass (m/z)理论分子量Theoretical Mass (m/z)质量精确度E。