甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产ＶＢ１２的影响.doc

1甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵产 ＶＢ１２的影响王振国 曹云峰 陈学军 李永亮 李昆太 张嗣良[摘要] 通过研究不同甲基供体（甜菜碱和氯化胆碱）对脱氮假单胞杆菌发酵产VB12 的影响，结果表明甜菜碱能显著促进 VB12 的生物合成；在此基础上考察了发酵培养基中甜菜碱浓度对 VB12 合成的影响，结果表明 15 g/L 的甜菜碱下VB12 的合成量最高；进一步研究了甜菜碱对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响，结果表明发酵液中一定浓度的甜菜碱可以显著提高 δ-氨基乙酰丙酸的合成量，从而促进 VB12 的合成[关键词] 甜菜碱；菌体生长；VB12 合成；δ-氨基乙酰丙酸；脱氮假单胞杆菌[Abstract] The effect of different methyl-group donors (betaine and choline chloride) on vitamin B12 production in shake flasks with Pseudomonas denitrificans was studied, and the results demonstrated that the addition of betaine to the fermentation medium could greatly stimulate biosynthesis of vitamin B12. Betaine concentration in fermentation medium was further investigated in shake flask, as a result, 15 g/L of betaine was the most beneficial for vitamin B12 synthesis. Moreover, the effect of betaine on the fermentation of P. denitrificans was studied, it was found that the δ-aminolevulinic acid (ALA) biosynthesis could be significantly improved when betaine was kept at certain concentration in the broth, thus the biosynthesis of vitamin B12 was greatly increased.[Key words] Betaine;Cell growth;Vitamin B12 biosynthesis;δ-aminolevulinic acid,;Pseudomonas denitrificans维生素 B12（VB12）通常用来表示钴胺素类化合物，它是一种重要的生物活性物质，可以用来治疗恶性贫血症，同时也是许多微生物和动物的生长因子[1]。

自然界中，VB12 的生物合成存在两种不同的途径，即好氧途径和厌氧途径，但是VB12 的生物合成严格局限于一些微生物中[2]，目前用于商业化生产 VB12 的微2生物主要有谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）、菲氏丙酸杆菌（P. freudenreichii）和脱氮假单胞杆菌（Pseudomonas denitrificans）等P. denitrificans 好氧合成 VB12 的途径已经详细阐明[3]正是由于对 VB12 合成途径的了解，所以可以通过诱变和分子生物学等手段来改造菌株，已经使得 P. denitrificans 菌株的VB12 生产能力大大提高[2]由于 VB12 产率高, 目前在工业生产中几乎都是使用 P. denitrificans 来作为好氧生产 VB12 的工业菌株P. denitrificans 好氧合成VB12 的过程一共需要 8 步甲基化[4]氯化胆碱（氯化-β-羟乙基-N,N,N-三甲基铵）和甜菜碱（三甲基甘氨酸）的每个分子含有三个甲基，它们通常作为生物合成VB12 的甲基供体White 等 [5]第一次报道在 P. denitrificans 中，甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶对 VB12 的大量合成具有非常重要的作用。

甜菜碱-高半胱氨酸转甲基酶催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基，分别形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸[6]，因此甜菜碱在参与 VB12 生物合成过程中的甲基化具有非常重要的作用Demain 等[7-9]的研究表明，甜菜碱对 P. denitrificans 中 VB12 的合成和卟啉的过量生成起着重要的作用另外，甜菜碱是一种良好的渗透压调节剂[10]，有文献报道甜菜碱和胆碱能促进细胞表面对代谢产物的分泌，从而对细菌产 VB12 具有刺激效果[11]甜菜碱在 VB12 发酵过程中具有非常重要的作用，但是目前很少有文献对甜菜碱所引起的 P. denitrificans 代谢变化情况进行分析本文主要考察了甜菜碱对P. denitrificans 菌体生长和 VB12 合成的影响，并通过研究发酵过程 pH 和 δ-氨基乙酰丙酸（ALA）合成量的变化，阐明了甜菜碱所引起的 P. denitrificans 代谢特征，为工业化发酵生产 VB12 中的甜菜碱控制工艺提供了重要依据1 材料与方法1.1 菌种和培养基菌种：脱氮假单孢杆菌（Pseudomonas denitrificans），石药集团河北华荣制药有3限公司。

种子培养基（g/L）：蔗糖 40，酵母膏 10， NH4Cl 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.1，pH 7.2~7.4发酵培养基(g/L)：蔗糖 80，酵母膏 30，(NH4)2HPO4 3.0，MgSO4·7H2O 2.0，CoCl2·6H2O 0.1，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI） 0.05，ZnSO4·7H2O 0.1，CaCO3 1.0，pH7.0～7.21.2 仪器与试剂仪器：8453 型紫外-可见分光光度计（Agilent 公司）；HP 1100 型色谱仪(Agilent 公司) 试剂：氰钴胺对照品(含量＞99％，河北华荣制药有限公司)，糖蜜（内蒙古兰田糖业有限公司），甜菜碱(河北华荣制药有限公司)，DMBI(河北科硕化工有限公司)，CoCl2·6H2O(山东临县汇丰钴厂)，ALA (Sigma 公司)，其他试剂均为国产分析纯1.3 发酵培养方法种子培养：用无菌水刮洗下斜面菌体，制成菌悬液取 1 ml 菌悬液接入装有 60 ml 种子培养基的 300 ml 三角瓶中，30 ℃，260 r/min 旋转式摇床振荡培养至菌体吸光值(OD700)为 10 左右。

摇瓶培养：300 ml 三角瓶中培养基装量为 36 ml，接种量 10％，32 ℃，于旋转式摇床（260 r/min）培养至 96 h1.4 测定方法菌体浓度(DCW)：采用测量菌体干重法(dry cell weight)吸 10 ml 发酵液，经离心和洗涤后，菌体烘干至恒重，称菌体干重VB12 测定：采用 HPLC 法将被测样品中不同形式的 VB12 转化为氰钴胺，流动相：V（250 mmol/L 磷酸水溶液）∶V（乙腈）= 30∶70；色谱柱：大连依利特 Hypersil NH2 柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；检测波长：361 nm；进样量：20 μl；流速：1.7 ml/min甜菜碱测定：比色法[12]，利用甜菜碱与雷氏盐发生反应δ-氨基乙酰丙酸(ALA)含量的测定：按照文献[13]的方法进行测定2 结果与讨论42.1 两种不同甲基供体对菌体生长和 VB12 合成的影响甜菜碱和氯化胆碱每个分子都含有三个甲基，常常作为发酵产 VB12 过程的甲基供体为了比较二者对 P. denitrificans 发酵产 VB12 的影响，在发酵培养基中分别加入 10 g/L 的甜菜碱、氯化胆碱，结果如图 1 所示：图 1 不同甲基供体对 P. denitrificans 发酵过程的影响Fig. 1The effects of different methyl-group donors on cell growth（solid）(a), broth pH (dash) (a) and VB12 synthesis (b) of P. denitrificans in shake flask由图 1a 可见，发酵培养基使用甜菜碱的菌体生长量明显要高于使用氯化胆碱，其最大 DCW 分别为 23.04 g/L 和 18.79 g/L。

使用甜菜碱作为甲基供体，发酵过程中的 pH 较为稳定，一直维持在 7.0 左右而使用氯化胆碱作为甲基供体，发酵液的 pH 急剧下降，第 48 小时后 pH 降低至 5.0 左右，pH 的下降很可能是由于氯离子积累而造成的由图 1b 可见，使用氯化胆碱的 VB12 效价明显低于使用甜菜碱的 VB12 效价，二者放瓶时（96 h）的 VB12 效价分别为 20.75 μg/ml 和 48.45 μg/ml2.2 甜菜碱浓度对 VB12 合成的影响在发酵培养基中加入甜菜碱，浓度分别为 0、5、10、15、20、30 g/L发酵 96 h后放瓶，结果见图 2图 2 不同浓度的甜菜碱对 VB12 合成的影响Fig 2. Effect of betaine on the cell growth and vitamin B12 biosynthesis of P. denitrificans从图 2 可以看出，在 P. denitrificans 发酵过程中，添加一定量的甜菜碱是十分必要的，它对 VB12 的合成具有明显的促进作用发酵培养基不加甜菜碱，虽然得到最大的菌体生物量，但是没有 VB12 的合成。

添加 15 g/L 甜菜碱的效果最好，5VB12 的效价达到 52.18 μg/ml2.3 甜菜碱对 P. denitrificans 发酵过程的影响为了研究甜菜碱对 P. denitrificans 发酵过程的影响，选择 15 g/L 和 30 g/L 的甜菜碱在摇瓶中作进一步实验，以不加甜菜碱作为对照 2.3.1 甜菜碱对pH 和菌体生长的影响图 3 为这三种不同浓度甜菜碱下，发酵过程的 pH 和菌体生长变化趋势图 3 不同浓度甜菜碱下发酵过程的 pH 和菌体生长变化趋势Fig. 2 Time course of pH (a) and cell growth (b) under various concentrations of betaine in shake flask culture by P. denitrificans. Symbols: -■- 0 g/L of betaine; -●-15 g/L of betaine; -▲- 30 g/L of betaine由图 3a 可见，培养基中不加甜菜碱，pH 在第 24 小时后明显下降，而加入 15 g/L 和 30 g/L 的甜菜碱，pH 较为稳定。

图 3b 显示的生物量变化表明，培养基中不加甜菜碱，菌体生长最快此外，15 g/L 甜菜碱下的菌体量明显高于 30 g/L 甜菜碱下的菌体量2.3.2 甜菜碱对 ALA 和 VB12 合成的影响图 4 为这三种不同浓度甜菜碱对发酵过程 ALA 和 VB12 合成的影响结果由图 4a 可见，培养基中不加甜菜碱，发酵液中的 ALA 含量明显低于 15 g/L和 30 g/L 甜菜碱下的 ALA 含量在 72 h 前，15 g/L 甜菜碱下的 ALA 含量还略高于 30 g/L 甜菜碱下的 ALA 含量由图 4 b 可见，培养基中不加甜菜碱，整个发酵过程的 VB12 合成量为 0由于 15 g/L 甜菜碱下的菌体生长较快，其 VB12 效价明显高于 30 g/。