基因芯片制备.doc

IS1 - [ . I ] \ \ ■<中南大学基因芯片探针实验报告学院 班级 姓名 学号实验背景随着人类基因组（测序）计划（Human genome project ）的逐步实施 以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列 得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长然而，怎样去研究 如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同 的课题为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速 的检测、分析就显得格外重要了基因芯片（又称DNA芯片、生物芯片）技 术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的 前景该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于400 ）探针分子固 定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信 号强度进而获取样品分子的数量和序列信息二、 基因芯片基因芯片又称为DNA微阵列（DNA microarray），基因芯片的制备主要有 两种基本方法，一是在片合成法，另一种方法是点样法1） 片合成法是基于组合化学的合成原理，它通过一组定位模板来决定基片表面上不同化学单体的偶联位点和次序。

在片合成法制备DNA芯片的 关键是高空间分辨率的模板定位技术和固相合成化学技术的精巧结合 目前，已有多种模板技术用于基因芯片的在片合成,如光去保护并行合成 法、光刻胶保护合成法、微流体模板固相合成技术、分子印章多次压印 原位合成的方法、喷印合成法在片合成法可以发挥微细加工技术的优 势，很适合制作大规模DNA探针阵列芯片，实现高密度芯片的标准化 和规模化生产美国Affymetrix公司制备的基因芯片产品在1.28*1.28cm2表面上可包含300,000个20至25mer寡核苷酸探针，每个探针单元的大小为10um X 10um其实验室芯片的阵列数已超过到1,000,000 个探针2） 基因芯片点样法首先按常规方法制备CDNA （或寡核苷酸）探针库，然 后通过特殊的针头和微喷头，分别把不同的探针溶液，逐点分配在玻璃、 尼龙或者其它固相基底表面上不同位点，并通过物理和化学的结合使探 针被固定于芯片的相应位点这种方式较灵活，探针片段可来自多个途 径，除了可使用寡聚核苷酸探针，也可使用较长的基因片段以及核酸类 似物探针（如PNA等）探针制备方法可以用常规DNA探针合成方法、 或PCR扩增的cDNA、EST文库等。

固定的方式也多种多样点样法 的优越性在于可以充分利用原有的合成寡核苷酸的方法和仪器或cDNA 探针库，探针的长度可以任意选择，且固定方法也比较成熟，灵活性大 适合于研究单位根据需要自行制备科研型基因芯片，制作点阵规模较小 的商品基因芯片三、实验内容本实验所采用的是片合成法，在玻璃表面上直接合成的探针手臂阵列， 与荧光标记的靶基因杂交进行检测25 bJLM- [painI1-2# tn*Ml SEActual Shu ndRNfli rragm*n? vrth DN4 m GsnisChlp^ arnayShining 4 hwr h+ C^n«Chlp* «nray humv 1»gg»»d DH4 Bwll hjrbridlz^d *0 glw\ z由于基因芯片一次完整实验的成本较高，因此对于基因芯片的制备以及应用只要求课外了解认识，在实验中我们只涉及探针的光脱反应四、 肽核酸 PNA由于 DNA 作为基因芯片探针材料存在较多的不足，例如杂交效率较 低、结构复杂等等，因此本实验以PNA作为基因芯片探针，肽核酸(PNA) 是具有类多肽骨架的DNA类似物，PNA的主链骨架是由N(2-氨基乙基卜 甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的oPNA可以特异性地与DNA 或RNA杂交，形成稳定的复合体。

PNA由于其自身的特点可以对DNA复制、基因转录、翻译等进行有针对的调控，同时作为杂交探针大大提高 了遗传学检测和医疗诊断的效率和灵敏度肽核酸(PNA)特异性地识别 和结合互补核酸序列被引进用于医学和生物学的研究，展示了其独特的 生化属性，成为了基因奥秘的探索者BasePNA作为基因芯片材料具有以下优势: 1) 探针长度短2) 更好的识别能力3) 更高的灵敏度五、 实验原理PNA 的一个氨 基(N-H)上带有一个 光敏基团NPPOC，在 接受紫外光照射是迅 速脱落，露出原本的 氨基，与靶基因进行 杂交掩模 1掩模 2UVNPPOC NPPOC NPPOC NPPOCNH NHUVNPPOCNPPOC脱保护bNPPOC-AdNPPOC-GNPPOC NPPOCA NPPOC A NPPOCcNPPOC NPPOCA NPPOC A NPPOCNPPOCG NPPOC NPPOC NPPOCA G A GNHATGNHGAG罟六、 实验材料以及设备1）实验玻片2）玻片固定装置3）染色剂4）光脱控制软件5）光脱发生装置七、 实验步骤1）选取玻片2）将玻片装入固定装置3）在玻片中反应池里注入染色剂3）将载有玻片的固定装置装入光脱发生装置4）由光脱控制软件控制光脱掩模的图案5）反应完成后，将玻片光脱后的图案打印出来八、 实验意义基因芯片与靶基因的杂交是一个非常精确的过程，往往微小的错误 例如光敏基团脱落不完全，或者光脱不均匀，则会直接影响到杂交检测 的结果，导致基因芯片的不可用。

因此在基因芯片的制备以及应用过程 中，快速准确的光脱反应显得十分的重要，目前实验室的光脱率已经能 够达到 99%，能够保证基因芯片的精准性因此这个实验对于基因芯片 的检测具有重大意义从这一次的实验，我了解到了更多关于基因芯片 的知识，以前觉得这些都高深莫测的技术，但现在发现这些技术实际上 就在我们的身边，因此我应该努力的学习好基本知识。