表观遗传药物对体细胞核移植胚胎发育的促进作用.doc

表观遗传药物对体细胞核移植胚胎发育的促进作用 马盼盼 杨树宝 栾维民 马馨 吉林农业大学动物科学技术学院 摘 要： 体细胞核移植 (somatic cell nuclear transfer, SCNT) 是利用卵母细胞胞质中的重编程物质对高度分化体细胞核进行重编程作用使其恢复全能性并发育为新个体的技术在 SCNT 过程中, 表观遗传修饰参与卵母细胞的重编程, 如 DNA甲基化修饰和组蛋白的翻译后修饰这些重编程的异常修饰会对 SCNT 胚胎的发育产生不良影响表观遗传药物, 如 DNA 甲基转移酶抑制剂和组蛋白去乙酰基酶抑制剂, 可改善表观遗传修饰的异常现象, 促进体细胞核移植重构胚的重编程该文对 SCNT 胚胎重编程过程中的异常表观遗传修饰以及近年来报道的表观遗传相关药物进行综述, 并进一步探讨了这些药物对 SCNT 胚胎发育的促进作用关键词： 表观遗传药物; 体细胞核移植; 重编程; 胚胎; 作者简介：栾维民 Tel:0431-8453480;E-mail:luanweimin1957@;作者简介：马馨 Tel:0431-8453812, E-mail:maxin3202@基金：吉林省自然科学基金 (批准号:20170101018JC) Progress on Epigenetic Drugs in Development of Somatic Cell Nuclear Transfer EmbryosMa Panpan Yang Shubao Luan Weimin Ma Xin College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University; Abstract： Somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a technology, which makes reprogramming of highly differentiated somatic cell nuclear by making use of cytoplasmic reprogramming material in the oocyte, finally restores the totipotency and develops into a new number. In SCNT, epigenetic modifications participate in reprogramming of oocyte, such as modifications of DNA methylation patterns and histone modification after translation, their abnormal expression has adverse impacts on the development of SCNT embryos. Epigenetic drugs, such as DNA methyltransferase inhibitors and histone deacetylase inhibitors, can improve the abnormal epigenetic modifications and promote the reprogramming of SCNT embryos. This paper summarizes the abnormal epigenetic modifications in the process of SCNT embryonic development as well as the progress of epigenetic drugs. The effects of the drugs on SCNT embryos development were discussed further.Keyword： epigenetic drugs; SCNT; reprogramming; embryos; 体细胞核移植 (somatic cell nuclear transfer, SCNT 技术已成功应用于家畜繁殖、转基因动物生产和濒危物种保护等领域。

牛是 SCNT 技术研究和应用最广泛的物种, 已有良种公牛克隆、高泌乳性能奶牛培育和濒危物种成功保护等报道, 然而 SCNT 的牛胚胎发育率以及胚胎移植后的出生率普遍较低[1]这主要是由于 SCNT 后, 基因组进行了重要的表观遗传修饰, 如 DNA 去甲基化和组蛋白修饰, 这些修饰对新形成的受精卵和随后的胚胎发育至关重要[2], 但在SCNT 的重编程中出现了错误的表观遗传修饰, 影响了胚胎的发育Thuan 等[3]和 Shen 等[4]的研究显示, SCNT 胚胎的低发育能力以及许多在克隆动物中的异常情况限制了卵母细胞重新编程体细胞核的能力为改善这种情况, 许多研究者对此进行研究, 并从表观遗传修饰方面应用表观遗传药物来提高 SCNT 胚胎的发育率和囊胚率本文对 SCNT 胚胎中的表观遗传异常以及表观遗传药物对SCNT 胚胎发育能力的影响进行了综述1 SCNT 中的表观遗传修饰1.1 早期发育阶段的表观遗传重编程正常的发育取决于染色质结构方面精确的序列变化, 主要与组蛋白的乙酰化和甲基化状态以及基因组 DNA 的甲基化相关这些表观遗传修饰精确地控制组织特异性基因的表达有研究者推测, 哺乳动物约含 25 000 个基因和 30 000~40 000 个 Cp G 二核苷酸序列。

这些 Cp G 序列主要存在于基因的启动子区, 启动子区一般位于基因上游 200~2 000 bp 非编码区, 这个区域 C+G 的含量大于 50%, Cp G 岛大于 0.6[5]Li 等[6]的研究表明, 在健康哺乳动物的发育中 Cp G 二核苷酸中胞嘧啶的正常甲基化是非常重要的, 并且 DNA 甲基化在抑制寄生性 (parasitism) 启动子活性中也起到了关键作用, 是真核细胞基因沉默系统的一部分在此之前, 甲基化作用被认为主要与基因的沉默相关, 但研究者发现, 越来越多的基因通过甲基化激活, 特别是肿瘤抑制基因和变异相关基因[6]因此, 表观遗传调控对实现多细胞生物的生物复杂性至关重要, 并且表观遗传调控的复杂性随基因组增大而增加[7]在哺乳动物的早期发育期间, 受精卵形成前后存在重组基因组 DNA 的修饰受精后, 父本的 DNA 主动并迅速地去甲基化, 而母本的 DNA 进行被动去甲基化, 多见于牛、猪、鼠和人类的受精卵[5]Ziller 等[8]和 Okae 等[9]在人类胚胎中对全基因组的 DNA 甲基化进行分析, 发现母本基因组被去甲基, 其在囊胚中的去甲基化程度小于小鼠, 这在人类基因组中有助于增加印记基因差异甲基化区域 (differentially methylated regions, DMRs) 的数目。

Ziller 等[8]还发现, 父本基因组发生全基因组去甲基化, 但 SINE-VNTR-Alu (short interspersed nuclear elements-variable number of tandem repeats-Alu) 成分和一些其他串联重复序列包含的区域被专一地保护, 不受全基因组去甲基化作用的干扰这些结果表明, 基因组 DNA 的重要部分不发生去甲基化, 暗示了表观遗传记忆的存在Dean 等[10]的研究发现, 胚胎的 DNA 越来越多地在两细胞和囊胚阶段再被甲基化, 这与胚胎基因组转录的物种特异性相关这些机制确保早期发育阶段的关键步骤, 包括第一次细胞分裂的时机、压缩、囊胚的形成、扩张和孵出, 受到精密调控基因的表达调控在生成的胚胎中, 辅助生殖技术的应用, 如体外受精的培养经常与异常的 m RNA 表达模式相关, 将伴随更大的表观遗传障碍和更高的异常表型风险[11]1.2 异常的表观遗传修饰各种 SCNT 动物的相继出生, 说明成熟卵母细胞有能力恢复已分化体细胞核的全能性Gurdon 等[12]的研究表明, 在卵母细胞中, 重组因子通过表观遗传修饰可参与高度压缩的体细胞染色质的分化, 允许额外的修饰, 使基因组转录因子参与到染色体中, 并建立胚胎发育程序。

事实上, 在配子基因组中, 高度乙酰化和低甲基化的染色质状态是相似的, 从而在正常发育中增加了它们的表达[2]然而, SCNT 后的错误重编程抑制了胚胎的发育, 这可能是由于在体细胞基因中基因的性质不同或更高的外基因标记的参与, 使受精后发育程序的重组机制遇到重大困难, 导致其不完整或不正确的重组[13]SCNT 中普遍存在 DNA 超甲基化和组蛋白低乙酰化等异常的表观遗传修饰, 这导致 SCNT 胚胎的低发育率及胎儿的低出生率和存活率Chan 等[10]和 Bortvin等[14]的研究发现, SCNT 胚胎异常的表观遗传修饰导致异常的基因表达谱, 这反过来造成发育障碍或畸形动物的出生, 例如胎儿和胎盘的超重、器官的异常大小、成年动物肥胖、呼吸困难或免疫缺陷等DNA 甲基化由 DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferase, DNMT) 介导, 并发生在 Cp G 二核苷酸序列胞嘧啶的 5 位碳原子位点上目前发现 4 个 DNMT:DNMT1是一种维护酶, 负责复制 Cp G 二核苷酸的甲基化模式, 复制后新合成半甲基化DNA 链[15], 而卵母细胞特异性异构体 DNMT1 维护母本的印记;DNMT3a 和DNMT3b 最终不显示 DNA 的半甲基化, 因此催化重新甲基化, 这在发育期间是非常关键的;DNMT2 与其他的 DNMT 同源, 但是只表现有限的甲基转移酶活性[16]。

Chen 等[16]的研究表明, DNMT3 家族的其他成员, 如 DNMT3 类似的蛋白质 (DNMT3L) , 没有 DNMT 活性, 但是在生殖细胞中参与印迹基因的甲基化, 并与DNMT3a 和 3b 相互作用重新刺激他们的甲基转移酶活性Klose 等[17]的研究显示, DNA 甲基化抑制基因表达, 主要是通过直接阻断 DNA的转录激活因子与目标基因结合, 或结合甲基-Cp G-结合蛋白 (methylCp G-binding proteins, MBP) , 从而结合染色质重塑辅抑制因子复合物使沉默基因表达, 以起到抑制作用DNA 甲基化对基因表达的影响最终在染色质结构中通过修饰维持, 由 MBP 和 DNMT 的活性来介导, 并结合组蛋白去乙酰基酶[histone deacetylases, HDACs, 也称为 KDACs (lysine deacetylases) ]和组蛋白甲基转移酶 (histone methyltransferase, HMT) 复合物SCNT 中的低乙酰化, 主要是 HDAC 在基因转录过程中具有重要的抑制作用组蛋白功能由多个翻译后修饰调控, 包括组蛋白赖氨酸 ε-氨基的可逆乙酰化作用。

组蛋白乙酰化作用通过对抗组蛋白乙酰基转移酶 (histone acetyltransferases, HATs) 和 HDACs 的活性之间的平衡严格调控人类有 18个潜在的 HDACs, 可分为 4 类通过去除组蛋白尾部的 ε-氨基赖氨酸残基的乙酰基, HDACs 可在转录调控中扮演至关重要的作用[18]核移植后, 核与胞质发生重组, 但 HDACs 去除了存在于已乙酰化的组蛋白及其他蛋白赖氨酸上的ε-氨基上的乙酰基, 使体内的乙酰化水平降低, 引起全面的核染色体聚集, 并导致转录抑制, 阻碍了核移植后细胞正常发育的重编程, 抑制了细胞的分化和发育, 这对 SCNT 的胚胎发育起到了不良的作用2 表观遗传药物表观遗传学, 又称“表遗传学”、“外。