微生物杂交育种.ppt

单击此处编辑母版标题样式,,单击此处编辑母版文本样式,,第二级,,第三级,,第四级,,第五级,,,,*,,,第九章 工业微生物杂交育种,,,第一节 微生物杂交,,第二节 细菌杂交育种,,第三节 放线菌杂交育种,,第四节 酵母菌的杂交育种,,第五节 霉菌杂交育种,,第六节 微生物原生质体育种,,第七章 微生物原生质体融合育种,,第八节 细菌原生质体融合育种,,第九节 放线菌原生质体融合育种,,第十节 酵母菌原生质体融合育种,,第十一节 霉菌原生质体融合育种,第一节 微生物杂交,杂交的意义,,微生物杂交育种基本程序,,杂交过程中亲本和培养基的选择,,杂交育种的遗传标记,,杂交育种方法,1.,独特优点,,(1),通过具有不同遗传性状菌株的杂交，使遗传物质进行交换和重新组合，改变亲株的遗传物质基础，扩大变异范围，使两亲株的优良性状集中于重组体内，获得新品种2),通过杂交后获得具有新遗传特性的重组体，不仅可克服因长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等缺陷，也可以提高对诱变剂的敏感性，降低对诱变剂的“疲劳”效应3),通过杂交可以总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。

1.1,,杂交的意义,2.,微生物杂交的本质和方式,,(1),本质,——,基因重组（体外）,,(2),方式,,细菌和放线菌等原核生物：两个亲本菌株细胞间接合，染色体部分转移，形成部分结合子,(merozygote),，最后经交换、重组直至重组体的产生真菌：通过有性生殖或准性生殖来完成1.1,,杂交的意义,1.2,微生物杂交育种基本程序,1.,亲本菌株的选择,,(1),原始亲本,:,具有不同遗传背景的优质出发菌株2),直接亲本,:,具有遗传标记和亲和能力而直接用于杂交配对的菌株，由原始亲本菌株经诱变剂处理后选出的具有营养缺陷型标记或其他遗传标记，又通过亲和力测定的直接用于杂交的菌株2.,培养基,,(1),完全培养基,,(2),基本培养基,,(3),有限培养基,:MM,＋,CM,（,10,～,20,％）,,(4),补充培养基：鉴别培养基、选择培养基,,(5),发酵培养基,1.3,杂交过程中亲本和培养基的选择,1.,营养缺陷型标记,,2.,抗性标记,,3.,温度敏感性标记,,4.,其他性状标记,1.4,杂交育种的遗传标记,1.,常规杂交育种,,,,,,,,,2.,原生质体融合育种,1.5,杂交育种方法,第二节 细菌杂交育种,细菌繁殖和遗传结构,,细菌杂交的概况和原理,,细菌杂交方法与技术,2.1,细菌繁殖和遗传结构,结构,:,,单细胞、拟核、,1,条环状染色体、质粒,,菌落,:,,母细胞为中心的一堆肉眼可见的有一定形,,态构造的子细胞集合体。

繁殖：,,裂殖：,,,二分裂,：横,>,纵,,,均,>,不,,,,三分裂,：,三维网格状含之,,,复分裂,：,蛭弧菌类,,芽殖：,芽生细菌,;,芽生杆菌属,;,生丝微菌属,;,生丝单胞菌属,;,硝化杆菌属,;,红微菌属1.,细菌接合与,F,性因子,2. 2,细菌杂交的概况和原理,F,－菌株：,无,F,因子F,＋菌株：,有,F,因子Hfr,菌株：,F,因子的,DNA,嵌入染色体,DNA,中F,’,菌株：,由不正常切割形成特殊,F,因子，携带有小段染色体基因,,2. 2,细菌杂交的概况和原理,2.,大肠杆菌杂交与菌株类型,Hfr,菌株与,,F,－菌株,,结合过程,F’,菌株的形成,2. 2,细菌杂交的概况和原理,2.,大肠杆菌杂交与菌株类型,由不正常切割形成,,,携带有小段染色体基因,,1.,杂交亲本菌株选择、标记菌株和性别菌株的获得,,(1),杂交亲本菌株选择,,(2),标记菌株,,(3),性别菌株的获得,,2.,杂交的方法,,(1),直接混合法：细菌杂交一般采用2),反选择标记：检出重组体3),非选择性标记：,2. 3,细菌杂交方法与技术,第三节 放线菌杂交育种,放线菌细胞结构与繁殖,,放线菌杂交概况和原理,,放线菌的杂交技术,3. 1,放线菌细胞结构与繁殖,三丝：基内菌丝、气生菌丝、孢子丝,1.,放线菌杂交原理,3. 2,放线菌杂交概况和原理,SCP,1,因子,（,1,） 接合,2.,放线菌杂交过程,3. 2,放线菌杂交概况和原理,（,3,） 重组体,（,2,）杂合系,(heterochone),和重组体杂合系,2.,放线菌杂交过程,3. 2,放线菌杂交概况和原理,主要杂交方法,3.3,放线菌的杂交技术,,3.3,放线菌的杂交技术,放线菌杂交育种的一般程序,,1.,混合培养法,,（,1,） 直接亲本是,,杂交配对菌株,,（,2,） 斜面混合接种,,（,3,） 单孢子悬液的制备,,（,4,） 重组体的检出,,（,5,） 杂合系分析,3.3,放线菌的杂交技术,Met-,甲硫氨酸,,Str-,抗性,,Phe-,丙苯氨酸,2.,玻璃纸法,,（,1,） 玻璃纸法的原理,,（,2,） 玻璃纸平板杂交的具体方法,,,,,,,,,（,3,） 分离子的检出和鉴别,3.3,放线菌的杂交技术,3.,平板杂交法,3.3,放线菌的杂交技术,第四节 酵母菌的杂交育种,一、酵母菌的细胞结构和菌落形态,,单细胞真核生物,,二、酵母菌的生活史和繁殖方式,有性杂交,三、酵母菌的杂交,,(,一,),标记菌株的选择,,(,二,),酵母杂交方法,,1.,子囊孢子的制备：成份贫乏的生孢培养基,,2.,杂交,第五节 霉菌杂交育种,霉菌的细胞结构和繁殖,,霉菌杂交的原理和杂交技术,,高产重组体的筛选,1.,霉菌细胞结构,,2.,霉菌的繁殖,,准性生殖,5.1,霉菌的细胞结构和繁殖,1.,异核体的形成与获得方法,,异核体与同核体,,异核体互补与喂养或互养,,A.,选择直接亲本：亲合力与遗传标记,,B.,异核体合成方法,,(1),完全培养基的混合培养法,,(2),基本培养基衔接法,,(3),有限培养基培养法,5.2,霉菌杂交的原理和杂交技术,(1),完全培养基的混合培养法,(2),基本培养基衔接法,(3),有限培养基培养法,1CM+9MM,2.,杂合二倍体的形成和检出,,(1),杂合二倍体的形成和诱变,,(2),杂合二倍体的表型,,,,,,,,,,(3),杂合二倍体的检出：角变、斑点,5.2,霉菌杂交的原理和杂交技术,3.,体细胞交换、分离和单倍化,,（,1,） 体细胞交换,,（,2,） 体细胞分离,5.2,霉菌杂交的原理和杂交技术,（,3,） 单倍化,,,,,,,,,,,,（,4,） 分离子,,亲本分离子、原养型分离子、异养型分离子,,二部体分离子、单倍体分离子、非整倍体分离子,,（,5,） 分离子的检出和测定方法,1.,杂交亲本选择，不仅要具有优良性状，而且最好是近亲配对组合；,,2.,采用适合的诱变剂处理杂合二倍体，使其适应酶系统代谢调控；,,3.,重组体在摇瓶筛选阶段，应做到条件和大生产条件尽量接近。

5.3,高产重组体的筛选,第六节 微生物原生质体育种,与正常细胞相比，原生质体具有的新特性：,,1.,对外界环境影响更敏感，对诱变剂的诱变效应更强烈；,,2.,破壁后细胞表面受体和噬菌体结合部位不复存在，失去对噬菌体的敏感性；,,3.,不受感受态的影响，可进行原生质体转化和融合等基因重组一、微生物原生质体再生育种,,1.,概念：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株2.,原生质体再生育种比常规育种正变率高的原因：,,(1),原生质体本身较为敏感；,,(2),原生质体再生本质上是细胞壁重建和分裂能力恢复的过程，再生的细胞壁可能在组成与结构上都发生变化；,,(3),常规诱变育种选用材料多为孢子，对诱变剂较迟钝，制备原生质体的材料则为对数生长期细胞，对诱变剂敏感；,,(4),原生质体再生材料无需经过遗传标记，减少了对菌株的损伤和优良性状的影响3.,原生质体再生育种的一般程序,,出发菌株的选择→菌种活化和预培养→ 原生质体制备→原生质体再生→高产菌株分离,(,初筛,)→,复筛→遗传稳定性鉴定→菌种特性及发酵特性研究4.,原生质体再生育种实例,二、微生物原生质体诱变育种,,(,一,),原生质体诱变育种方法,,1.,物理诱变剂诱变原生质体的一般程序,,2.,化学诱变剂诱变原生质体的一般程序,,(,二,),原生质体诱变育种实例,,1.,扩展青霉,PF-868,原生质体制备,:,纤维素酶,,2.,原生质体再生,,3.,原生质体诱变,,4.,突变株鉴定,三、微生物原生质体转化育种,,四、微生物原生质体融合育种,,五、其他微生物原生质体育种,第七章 微生物原生质体融合育种,与常规杂交相比，原生质体融合具有以下优势：,,1.,大幅度提高亲本之间重组频率（,10,-1,）,,2.,扩大重组的亲本范围（远缘间产生融合子）,,3.,原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本优良性状的机会更大。

原生质体融合杂交的原理和融合程序,原生质体融合育种的主要步骤：,直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备与再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体分离,遗传特性分析与测定,一、直接亲本及其遗传标记选择,,1.,直接亲本的选择,,一般采用具有较大遗传差异的近亲菌株，重组后的新个体具有更大的杂种优势,,2.,遗传标记的选择,,常用方法：带隐性性状的营养缺陷和抗性标记之外，也可采用热致死、孢子颜色和菌落形态等作为标记灭活法：在实际工作中难以找到符合要求的标记菌株时，最好采用灭活，把双亲中任何一方的原生质体用热灭活或用紫外线、药物灭活，然后与另一方具有正常活性的原生质体融合而获得重组体新融合筛选方法：荧光标记法二、原生质体制备与再生,,(,一,),原生质体制备,,活性原生质体制备过程：原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤细胞去壁与原生质体分离：,,细胞去壁后，原生质体从中释放出来的过程为原 生质体分离去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法，其中最有效、最常用的是酶法酶法分离原生质体的主要步骤,,1.,酶法分离原生质体的影响因素,,(1),培养基组成,,(2),菌体培养方式,,(3),菌体菌龄,,(4),稳定剂：高渗溶液,,(5),酶解前的预处理：,Triton-100,、,EDTA,,(6),酶系和酶的浓度：细菌－溶菌酶,,真菌－蜗牛酶,,(7),酶的作用温度和作用,pH,值,,(8),菌体密度,,(9),酶解方式,2.,原生质体的鉴定（分离程度）,,(1),低渗爆破法,,(2),荧光染色法（红光）,,3.,原生质体的收集和纯化,,(1),过滤法,,(2),密度梯度离心法,,(3),界面法,,(4),漂浮法,,4.,原生质体的活力鉴定,,(1),荧光素双醋酸盐染色法（有荧光）,,(2),酚藏花红染色法（红色）,,(3),伊文思蓝染色法（无色）,,5.,原生质体的保存：低温、液氮、,DMS,(,二,),原生质体再生,,三个阶段：,,大分子合成与原生质体生长阶段,,细胞壁合成与再生阶段,,分裂能力恢复并开始分裂繁殖成为正常细胞形态和菌落阶段,,1.,原生质体再生的影响因素,,(1),菌体生理状态,,(2),稳定剂：高渗,,(3),酶浓度和酶作用时间,,(4),再生培养基组成,,(5),残存菌体的分离,,(6),原生质体密度,,(7),再生培养基上的冷凝水影响：培养基出汗,,(8),再生方法：双层平板法,,2.,再生率及其计算,三、原生质体融合,,(,一,),原生质体融合过程,,霉菌：两亲株原生质体混合于高渗稳定液中,,在,PEG,的诱导下，两个或两个以上凝聚成团,,相邻原生质体紧密接触的质膜面扩大，相互接触的质膜消失,,细胞质融合，形成一个异核体细胞,,异核体的细胞在繁殖过程中发生核的融合，形成杂合二倍体,,通过染色体交换，产生各种融合子,(fusant),。

二,),原生质体融合的影响因素,,1.,融合剂,,化学融合剂：,PEG,，分子量,4000,～,6000,,物理融合剂：电场和激光,,2.,温度,,3.,亲株的亲和力和原生质体的活性,,4.,无机离子,,5.,其他条件,四、融合体再生,,(,一,),融合体再生,,融合体再生包括：融合体细胞壁合成、重建和融合体的再生，具体过程与一般原生质体再生相同二,),融合体的检出与分离,,原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体 两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定1.,利用营养缺陷型标记选择融合体,,2.,利用抗药性选择融合体,,3.,用灭活原生质体检出融合体,,4.,利用荧光染色法选择融合体,,5.,双亲对碳源利用不同而检出融合体,,6.,融合体的其他选择方法,五、融合重组体检出与遗传特性分析,,(,一,),重组体的检出和鉴别的方法,,1.,直接法,2.,间接选择法,,,,,,,,,,,3.,钝化选择法,,指灭活原生质体和具活性原生质体（营养缺陷型标记）融合。

二,),融合率,(,三,) DNA,含量及孢子形态测定,,重组体的进一步鉴定,,1. DNA,含量测定,,2.,单倍化,,3.,有关酶活性及孢子体积测定,,4.,分子生物学方法,六、原生质体融合的应用,,1.,提高产量或质量，合成新物质,,2.,改良菌种遗传特性,,3.,优化菌种发酵特性,,4.,质粒转移,,5.,原生质体与细胞核融合,,6.,进行遗传分析,第八节 细菌原生质体融合育种,一、概述,,1.,细菌类型和细胞壁特点,一、概述,1.,细菌类型和细胞壁特点,教程,21,页图,2-3,,,,,,,外膜蛋白,＋,＋,N-,乙酰葡糖胺（,G,）,N-,乙酰葡糖胺（,M,）, -,1,4-,糖苷键,肽桥,,四肽尾,,,肽桥,G,+,G,-,,,稀疏的网套,2.,溶菌酶和青霉素对细菌细胞壁的作用机制,①,②,二、细菌原生质体融合育种一般程序,三、细菌原生质体融合育种技术,,(,一,),培养基与溶液,,1.,常用培养基,,2.,高渗溶液,,(,二,),细菌原生质体融合育种,,1.,提高细菌原生质体制备率和再生率的方法,,(1),预处理：,EDTA,、表面活性剂,,(2),溶菌酶,,(3),细菌生理状态,,(4),培养基组成与培养条件,,2.,建立最佳融合体系,,3.,重组子分离模型,(,三,),操作方法,,1.,细菌原生质体的制备方法,,2.,细菌原生质体制备率,,3.,细菌原生质体再生,,4.,原生质体融合,,6.,重组体分析和鉴定,第九节 放线菌原生质体融合育种,一、放线菌细胞壁组成、结构及水解,,(,一,),细胞壁组成和结构：类似于,G,＋,菌,,(,二,),细胞壁水解,,1.,水解酶,,2.,酶解环境条件,二、放线菌原生质体融合育种技术,,(,一,),培养基与溶液,,(,二,),菌体培养及预处理,,(,三,),原生质体制备,,(,四,),原生质体再生,,(,五,),原生质体融合与再生,,(,六,),融合体的检出,第十节 酵母菌原生质体融合育种,一、酵母菌细胞壁结构和遗传标记,,单细胞真核微生物,二、酵母菌原生质体融合育种技术,,(,一,),出发亲本菌株的筛选及单倍体分离,,(,二,),酵母菌原生质体融合常用培养基与溶液,,(,三,),原生质体制备：蜗牛酶,,(,四,),原生质体再生,,(,五,),酵母菌原生质体融合,,(,六,),融合重组体鉴定与遗传分析,,第十一节 霉菌原生质体融合育种,霉菌原生质体融合育种程序,二、培养基及溶液,,三、霉菌原生质体融合分关键步骤,,(,一,),霉菌原生质体制备：多种水解酶,,(,二,),原生质体再生,,(,三,),原生质体融合和再生,,(,四,),融合重组体分析与鉴定,。