脊髓压迫性损伤后脱髓鞘病变及MBP、Id2的表达变化.doc

脊髓压迫性损伤后脱髓鞘病变及MBP、Id2的表达变化黄思琴1，漆 伟2，孙善全2，汪克建2，卓 飞2 (400016 重庆，重庆医科大学：中医药学院1，解剖学教研室2)[摘要] 目的 探讨脊髓压迫性损伤（compressed spinal cord injury, CSCI）后脱髓鞘病变与髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)、DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding2，Id2)的表达变化之间的关系，分析CSCI脱髓鞘病变机制方法 采用自行设计的方法制作脊髓压迫模型，通过电镜分别于压迫后1、3、7 d检测CSCI后神经纤维脱髓鞘病变的超微结构；运用免疫荧光双标和免疫印迹(Western blot)技术检测MBP及Id2的表达变化结果 CSCI后，出现脱髓鞘病变，并随着压迫时间延长，髓鞘逐渐发生水肿、变性、崩解；脊髓损伤后MBP表达下调，其表达趋势与脱髓鞘溃变的严重程度一致；CSCI后，Id2广泛分布于白质，随着压迫时间延长，其表达逐渐上调结论 MBP、Id2的表达变化与CSCI后神经纤维脱髓鞘病变的关系密切，是CSCI后神经纤维脱髓鞘病变的机制之一。

[关键词] 脊髓压迫性损伤；脱髓鞘病变；髓鞘碱性蛋白；DNA结合抑制物2[中图法分类号] [文献标志码] AAxonal demyelination after compressed spinal cord injury and alteration of MBP and Id2 expressionHuang Siqin1, Qi Wei2, Sun Shanquan*2, Wang Kejian2, Zhuo Fei2 (1.Traditional Chinese Medicine college 2.Department of Anatomy, Chongqing Medical University, Chongqing, 40016, China)[Abstract] Objective To investigate the correlation between the demyelination after compressed spinal cord injury and alteration of myelin basic protein and inhibitor of DNA binding2 expression, and explore the mechanism of demyelination after CSCI. Methods The CSCI model was established with a self-made device. The ultrastructure changes of nerve fibers in white matter were determined under electronic microscope at 1d, 3d, 7d following CSCI. Myelin basic protein and inhibitor of DNA binding 2 expressions were observed by double labeling immunofluorescence and western blotting. Results Demyelination occurred after CSCI and became swollen, degenerative and brokedown with the duration of time. The expression of myelin basic protein was regulated downward after CSCI and coincided with the degree of demyelination. Id2 distributed widely in white matter and the expression of Id2 increased with time after CSCI. Inclusion MBP and Id2 are correlated with demyelination which may contribute to demyelination after CSCI.[Key words] compressed spinal cord injury; demyelination;myelin basic protein; inhibitor of DNA binding 2 Supported by National Natural Science Foundation of China（30270437）,Natural Science Foundation of Chongqing (CSTC2012jjA10020), scientific technology item of Education Committee, Chongqing（KJ120312）, scientific technology item of Science and Technology Committee of Yuzhong District, Chongqing（20110316）,traditional Chinese medicine scientific technology item of Health Bureau, Chongqing （2012-2-138）. Corresponding author: E-mail:sunsq2151@[基金项目] 国家自然科学基金（30270437）,重庆市自然科学基金（CSTC2012jjA10020），重庆市教委科学技术研究项目（KJ120312），重庆市渝中区科技计划项目（20110316），重庆市卫生局中医药科技项目（2012-2-138）[通信作者] 孙善全，E-mail:sunsq2151@脱髓鞘病变是脊髓压迫性损伤（compressed spinal cord injury, CSCI）后的重要病理改变之一，造成神经冲动在传导中发生扩散，阻碍轴突的电传导，导致运动协调性异常（肢体不稳），肌肉痉挛或瘫痪等不可逆的神经功能损害的出现。

目前关于CSCI后脱髓鞘的研究报道较少，特别是脱髓鞘病变的机制尚不清楚研究报道，髓鞘的主要结构蛋白即髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)是检测脱髓鞘病变的敏感指标[1]，同时MBP受DNA结合抑制物2(inhibitor of DNA binding2，Id2)的负向调控[2]，因此，研究MBP和Id2的表达变化对认识大鼠CSCI后脱髓鞘病变机制有重要的意义本研究运用自行设计的方法制作CSCI模型，观察MBP及Id2的表达变化，探讨CSCI后脱髓鞘病变与MBP、Id2的表达变化之间的关系,分析CSCI脱髓鞘病变机制1 材料与方法1.1 实验动物 健康成年SD大鼠51只，雌雄不拘，SPF级，体质量250～300 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置方法符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准按随机数字表法将大鼠分为3组：正常对照组共3只，每个时间点1只；假手术组共3只，每个时间点1只；模型组共45只，每个时间点15只在造模过程中，分别于1、3、7 d取材，备用1.2 实验试剂及仪器 Id2抗体和MBP抗体购自Santa Cruz公司，少突胶质细胞标记物(rip)购自Millipore公司，驴血清、荧光二抗购自Jackson公司，多聚甲醛、蔗糖、橘掾酸铅、醋酸铀、中性树胶等为国产分析纯试剂，锇酸为南非进口分装试剂，恒冷切片机（Leica CM1900，German），显微照相系统（Olympus-45），透射电子显微镜(Hitachi-7500)，激光共聚焦显微镜（leicaTCS-SP2）。

1.3 CSCI模型的制备正常对照组不作任何处理，假手术组只做全椎板切除术，不做脊髓压迫用自行设计的大鼠脊髓压迫器[3]制备模型组用3.5％的水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，无菌操作显露胸11至腰3椎板，切除第1腰椎的椎板及前后关节突，显露腰1椎体对应的脊髓，将脊髓压迫钢板直接置于暴露的脊髓上，然后将内固定器卡在胸12的上下后关节突分叉和腰2的棘突根部之间将螺钉从内固定器小孔内拧入，直至螺钉的前端与压迫钢板接触，然后逐层缝合，将螺帽暴露在皮肤外待麻醉苏醒后，大鼠下肢及大小便功能须完全正常，显示无脊髓损伤，即造模成功术后第1天将螺钉拧入相同的圈数造成大鼠双下肢瘫痪，大小便失禁每日给大鼠挤尿4、5次，并进行抗感染、预防压疮等处理1.4 超微结构检测神经纤维脱髓鞘变化在造模的第1、3、7天，模型组各选择5只大鼠，正常对照组和假手术组各选择1只大鼠用3.5％水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉动物，打开胸腔暴露其心脏，经左心室插管至升主动脉起始处，剪开右心耳，用微量泵灌注4 ℃生理盐水200 mL，待流出液清亮后，再用2.5％戊二醛(0.1 mol/L PBS配制，pH 7.4)400 mL灌注固定后，取脊髓组织1 mm3，用4％戊二醛再固定4 h，l％锇酸后固定1 h，逐级酒精丙酮梯度脱水，环氧树脂618#包埋，超薄切片，片厚50 nm，橘掾酸铅、醋酸铀双重染色，在Hitachi-7500型透射电镜下观察神经纤维超微结构变化。

1.5 免疫荧光染色检测Id2与rip共表达变化 在造模的第1、3、7天，模型组各选择5只大鼠，正常对照组和假手术组各选择1只大鼠麻醉动物后，开胸暴露心脏，经左心室，主动脉插管，并剪开右心耳，用微量泵灌注4 ℃生理盐水200 mL，待流出液清亮后，灌注40 g/L多聚甲醛450 mL灌注固定，然后取出以伤段脊髓为中心，长约2 cm的脊髓，30％蔗糖脱水过夜(4 ℃)；待脱水完全后，用恒冷冰冻切片机连续切片，片厚10 μm，备用将不同时间点的冰冻组织切片在0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗10 min×3次，在微波炉里高火3 min，低火5 min进行修复，然后自然冷却用驴血清37 ℃水浴箱封闭1 h分别滴加羊和小鼠来源的一抗Id2和rip，覆盖标本，切片置于湿盒，4 ℃冰箱孵育24 h0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗10 min×3次滴加驴抗山羊、抗小鼠的荧光二抗，37 ℃水浴箱孵育1 h0.01 mol/L PBS冲洗10 min×3次加DAPI染核，室温5 min，0.01 mol/L PBS冲洗10 min×3次，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照1.6 Western blot检测MBP和Id2蛋白表达变化以β-actin作为内参照，分别取各时间点CSCI脊髓标本约30 mg。

加入液氮，研磨组织根据细胞量吸取全蛋白裂解液1 mL，加入一定量的蛋白酶抑制剂后加入到细胞内，12 000 r/min离心10 min，吸上清，测蛋白浓度提取总蛋白，Lowry法进行蛋白定量，取上清液煮变性后按照蛋白定量结果进行加样经12％十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2 h然后转移至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶粉37 ℃封闭，室温反应2 hTBST洗膜后分别加入Id2抗体和MBP抗体孵育，4 ℃过夜TBST洗膜后加入辣根过氧化物标记的相应二抗，室温反应2 hTSBT洗膜后加入DAB显色1.7 统计学处理数据以±s表示，采用SPSS 17.0统计软件行t检验2 结果。