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GE Western Blotting Troubleshooting实验问题 可能原因解决方案Western Blotting 转印中的1问题转印后膜上蛋白少或没 有凝胶与膜接触不好1. 确保转印时滤纸、凝胶、膜摆放位置正确 并接触紧密，无气泡2. 转印后，膜可以用丽春红染色或者预染 marker检查转印效率3. 转印中使用较厚的专用转印滤纸转印装置正负极摆放不对1. 确保膜处在阳极位置，凝胶在阴极2. 确保转印正负电极连接位置正确目的蛋白被其他高丰度蛋白掩 盖，如白蛋白，IgG等1.去除高丰度蛋白膜上蛋白条带出现smear拖尾转印中过热对于湿转：1. 确保转印槽中buffer没过转印模块2. Buffer可先预冷或者在4度环境下转印3. 降低转印电流电压，延长转印时间 对于半干转：1. 降低转印电流，不要超过0.8 mA/cm22. 增加转印滤纸数量蛋白样品过量或者有杂质干扰， 如脂类、核酸、IgG、白蛋白等1.请参考GE样品制备指南，去除杂质分子量小的蛋白转印效 率低小蛋白在膜上结合量少1. 使用蛋白结合能力更强的PVDF膜2. 增大SDS-PAGE凝胶浓度3. 使用0.2 Mm孔径的膜。

转印buffer中残留的SDS影响蛋白与膜的结合1. 转印buffer中不要有SDS2. 转印前凝胶与转印buffer平衡至少15min以上转印buffer中甲醇浓度太低1.提高甲醇的浓度（15%-20%）蛋白结合时间不够1.调低电压，延长转印时间分子量大的蛋白转印效 率低甲醇浓度太高1.降低甲醇浓度至10%（V/V）以下蛋白结合时间不够1. 使用湿转代替干转2. 延长转印时间蛋白凝胶浓度太高1. 降低凝胶浓度2. 转印buffer中添加0.1%SDS，促进蛋白溶 解注意：SDS可以促进蛋白的溶解， 但是也会破坏蛋白与膜的结合）半干转印时效率低电流未经过转印“三明治”1. 确保滤纸、凝胶和膜的尺寸大小一致2. PVDF膜预先用甲醇浸泡，转印三明治先 用转印buffer充分浸湿转印后膜上蛋白不平整气泡的影响1. 转印前确保膜充分浸湿2. 使用玻璃棒赶除气泡指纹污染1.操作时戴手套，避免手指于膜直接接触膜变干1.避免膜变干实验问题可能原因解决方案Western Blotting标记与检测中的问题信号弱封闭液不合适（封闭液可与目的 蛋白相结合）1. 更换不同的封闭液，或者降低封闭液浓 度2. 使用生物素/链霉素检测系统时，不要使 用牛奶作为封闭液。

3. 降低封闭液中去污剂的浓度，通常 0.05%-0.1% Tween-20 或 SDS 足够去除膜 的高背景（可以尝试使用TritonX-100代 替 Tween-20）4. 对于单抗或者高度纯化的抗体，封闭液中 不含去污剂效果会更好5. 优化洗涤的次数降低信噪比6. 如果检测磷酸化的蛋白，避免使用含有磷 酸的缓冲液（如PBS）过度封闭1.室温封闭不超过1hr或者低温4度过夜曝光时间过短1.延长曝光时间抗体结合时间不够或者温度不 合适1. 一抗或二抗在室温通常结合1-2小时，时 间过短容易导致弱信号2. 如需要长时间抗体反应,可以在4度下孵 育12-16小时一抗选择不合适1.确保一抗能够识别目的蛋白，可通过 dot-blot 检验抗体浓度太低1.优化抗体浓度二抗被NaN3保护剂抑制1.如果二抗是HRP标记的，确保二抗中不 含有NaN3保护剂蛋白的上样量太少1.增大上样量抗体或者检测试剂过期1.检查Western Blotting相关试剂有效期没有信号抗体浓度太低1.优化抗体的使用浓度二抗种属问题1.确保二抗能够识别所用的一抗使用的一抗是天然蛋白免疫制 备的1.天然蛋白免疫制备的抗体可能不能识别 变性的蛋白，检查抗体的厂家信息，确保 可以用来检测你的目的蛋白。

检测试剂过期1.确保检测试剂的有效期，设置阳性对照空白带信号太强，底物被消耗1.降低抗体浓度或者蛋白上样量高背景膜上具有非特异结合的蛋白1. 提高封闭液浓度或延长封闭时间2. 确保实验中用水、转印没有污染洗涤不够1. 增加洗涤次数，延长洗涤时间2. 洗涤 buffer 中添加 0.1%（V/V ）的 Tween-20可以在洗涤缓冲液中添加0.5M NaCl或者0.2% SDS有利于降低背景）封闭不足1. 更换封闭液，并确保封闭液充分溶解2. 提高封闭液浓度和延长封闭时间二抗浓度太高1.优化抗体浓度封闭液与抗体交叉反应，需更换 封闭液1.比如检测磷酸蛋白，建议使用BSA代替 牛奶作为封闭液，因为牛奶中含有磷酸化 的蛋白非特异条带一抗，二抗浓度太高1.优化抗体浓度上样量太大1.降低上样量非特异的小蛋白带1. 可能是目的蛋白降解产生的请参考GE 样品制备指南，建议样品制备时冰上快速 操作，添加蛋白酶抑制剂等2. 选择与小蛋白带没有交叉反应的抗体3. 目的蛋白可能有多种亚型或者具有不同 的亚基组成非特异的大蛋白带1.可能是目的蛋白的不同修饰造成的一抗的特异性不好1.使用更严格的洗涤条件荧光Western Blotting相关问题高背景膜上的荧光背景太强1. 使用低荧光膜，比如Hybond-LFP （PVDF 膜）或者Hybond ECL膜（NC膜）2. 跑胶时，确保溴酚蓝已经跑出凝胶，溴酚 蓝会干扰荧光信号。

3. 当使用Cy3标记的二抗时，使用Tween-20 作为去污剂，TritonX-100会干扰Cy3的荧 光信号4. 洗涤最后一步使用PBS或者TBS去除去污 齐UMultiplex 问题与实验设计相关1.确保二抗能有效地分开不同种属的一抗斑点背景膜上有灰尘污染/圆珠笔做记号1. 避免手指与膜接触2. 使用70%乙醇擦拭扫描仪，保证成像相关 物品干净3. 避免使用圆珠笔在膜上做记号低信号漂白1.荧光基团标记的抗体需要避光，避免光漂 白激发光及滤光片选择不对1.使用的正确的激发光及滤光片成像仪的设置不对1.选择合适的曝光时间和检测器的强度。