维生素K3对光老化HaCaT细胞保护作用的研究.docx

    维生素K3对光老化HaCaT细胞保护作用的研究    韩伊杨 魏志平 杜佳溪 陈娇[摘要]目的：探讨维生素K3对UVA辐照下角质形成细胞的光保护作用及相关机制方法：以5J/cm2的UVA辐照HaCaT细胞建立光老化细胞模型采用不同浓度（0、0.125μM、0.25μM、0.5μM）的维生素K3预处理HaCaT细胞24h;CCK-8方法检测细胞增殖活性;活性氧（ROS）检测荧光探针2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）检测细胞内活性氧水平;Western blot法检测各组细胞MMP1、COX2、LC3B蛋白的表达结果：与单纯光照组相比，维生素K3能够促进光老化HaCaT细胞的体外增殖，且呈浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05）;药物干预组HaCaT细胞的ROS含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）;细胞内MMP1、COX2蛋白表達降低，LC3B表达增高，差异有统计学意义（P<0.05）结论：维生素K3能够对UVA辐照HaCaT细胞提供光保护作用，其机制可能与促进细胞自噬有关[关键词]HaCaT细胞;光老化;紫外线A;维生素K3;自噬[]R339.3+8    [文献标志码]A    []1008-6455（2020）12-0102-04Protective Effect of Vitamin K3 on Photoaged HaCaT CellsHAN Yi-yang1，WEI Zhi-ping2，DU Jia-xi1，CHEN Jiao1（1.Graduate School of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，Jiangsu，China;2.Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221002，Jiangsu，China）Abstract： Objective  To explore the photoprotective effect of Vit K3 on keratinocytes under UVA irradiation and related mechanisms. Methods  HaCaT cells were irradiated with 5J/cm2 of UVA to establish a photoaging cell model. HaCaT cells were pretreated with Vit K3 at different concentrations （0， 0.125μM， 0.25μM， 0.5μM） for 24h. Proliferation of cells was detected by CCK-8 method. Reactive oxygen species （ROS） detection fluorescent probe 2'，7'-dichlorofluorescein yellow diacetate （DCFH-DA） was used to detect intracellular reactive oxygen level. The expression of MMP1， COX2 and LC3B was detected by Western blot. Results  Compared with the light-only group， Vit K3 could promote the proliferation of HaCaT cells in a concentration dependent manner， the difference was statistically significant （PKey words： HaCaT cells; photoaging; Ultraviolet A; Vitamin K3; autophagy光老化被认为是紫外线辐射损伤在皮肤老化基础上的叠加，作为一种退变过程而引起人们的广泛关注[1]，尤其是A型长波紫外线（UVA），UVA过度辐照将导致皮肤红斑生成、ROS异常表达、MMPs、COX-2等生成并导致炎症发生，推动光老化[2]。

自噬与衰老密切相关，具有许多共同的特征，在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，这表明两者在细胞中可能发挥相似的功能和作用[3]随着研究的进展，许多证据提示：自噬，同样可能与有机生物体内最大的器官-皮肤组织的老化密切相关研究证实，自噬可以通过清除UV辐照细胞内受损的蛋白质和脂质，修复DNA，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用[4]适度的自噬有助于抑制紫外线损伤皮肤角质形成细胞，维持正常的细胞自噬水平有助于抵抗UVA所致的光老化[5]维生素K3（Vit K3）是一种合成的类似Vit K的物质，作为维生素原在体内转化为活性形式最近一些研究表明，Vit K3具有诱导细胞自噬的功能[6]鉴于此，本实验以人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）作为体外UVA辐照光老化细胞的模型，旨在初步探索Vit K3对UVA辐照下角质形成细胞的生物学作用，以期进一步为光老化治疗的研究提供理论依据和新的思路自噬的失調可导致多种皮肤病的发生并导致皮肤衰老[7]一项角质形成细胞中的体外研究发现，自噬诱导可增强角质形成细胞中核因子E2相关因子2依赖性的抗氧化反应[8]而Atg7基因（自噬相关基因7）灭活小鼠的体内研究中也显示，在缺乏自噬的情况下，细胞将表现出DNA损伤、细胞周期阻滞和脂质表型紊乱等典型的早衰[9]。

以上研究均提示，从细胞自噬的角度来了解衰老皮肤的特征，发现与应用自噬调节药物，对于治疗和预防紫外线所致的皮肤疾病具有重要意义[10]而近年来关于维生素K3的促自噬效应受到了广泛的关注为了阐明维生素K3自噬功能与光老化的关系，本实验以体外UVA损伤的HaCaT细胞为光老化模型，进行实验，首先观察了紫外线辐射对角质形成细胞形态及生理活性的影响，其次检测光老化细胞中相关蛋白标记物的表达，继而探讨维生素K3对光老化模型中HaCaT细胞的作用在现有的机制学说认为，UVA辐射通过上调角质形成细胞中基质金属蛋白酶1（MMP-1）的表达，诱导破坏细胞外包括胶原蛋白在内的基质蛋白，从而导致皮肤结构完整性受损[11]而环氧化酶-2（COX-2）是一种诱导产生前列腺素的酶，该酶在上表皮高表达，受光、生长因子和细胞因子的调控[12]UVA辐射将导致细胞内COX-2表达上调，诱导角质形成细胞增殖、表皮增生、炎症和水肿，加速光老化的进展在本实验中，分别检测了上述光老化损伤的标志性生物分子的表达结果发现，与单纯UVA照射组比较，Vit K3药物干预组这些标记物的表达得到抑制该结果证实了本次假设，即Vit K3可以减轻UVA诱导的光损伤。

UV已报导可通过下调细胞中抗紫外线相关基因（UVRAG）和p53的表达导致自噬溶酶体功能障碍[13]微管相关蛋白3（LC3）是一种可溶性蛋白，在哺乳动物组织和培养细胞中广泛表达，与自噬相关，反映了自噬活性[14]为了探究UVA诱导的HaCaT细胞光老化与自噬的联系，进行了蛋白免疫印迹实验结果表明，Vit K3的加入在一定程度上恢复了受抑制的LC3-Ⅱ蛋白表达由此，可以推测UVA诱导HaCaT细胞光老化及Vit K3作用的可能通路：UVA辐射抑制了HaCaT细胞内自噬水平，使得自噬介导的细胞自我清除由UVA诱导产生的ROS、COX-2和MMP-1等因子的能力下降，上述因子在细胞内发生异常积聚;而皮肤组织在这些因子的作用下，出现胶原纤维的合成减少、降解增多，炎症反应增多，皮肤组织结构失去完整性，最终叠加在内源性老化基础上，推动皮肤粗糙、干燥、血丝增多等光老化进程[15]综上所述，笔者认为Vit K3不仅可以逆转UVA照射引起的细胞活力下降，还可以抑制光化细胞中的COX-2，MMP1的生成重要的是，发现UVA可以抑制自噬，减少LC3-Ⅱ的形成，而Vit K3由于其自噬诱导特性可以抑制这种作用。

结果表明，Vit K3可以通过自噬激活有效地保护HaCaT细胞不受光老化的影响，为Vit K3对抗皮肤光老化的机理提供了可能的理论依据，以及为Vit K3可能进一步开发为抗光老化药物提供了理论基础[参考文献][1]Tobin DJ.Introduction to skin aging[J].J Tissue Viability，2017，26（1）：37-46.[2]Battie C，Jitsukawa S，Bernerd F，et al.New insights in photoaging， UVA induced damage and skin types[J].Exp Dermatol，2014，23（Suppl 1）：7-12.[3]Leidal AM，Levine B，Debnath J.Autophagy and the cell biology of age-related disease[J].Nat Cell Biol，2018，20（12）：1338-1348.[4]Wang M，Charareh P，Lei X，et al.Autophagy： multiple mechanisms to protect skin from ultraviolet radiation-driven photoaging[J].Oxid Med Cell Longev，2019，2019：8135985.[5]Endo K，Katsuyama Y，Taira N，et al.Impairment of the autophagy system in repetitively UVA-irradiated fibroblasts， photodermatology[J].Photodermatol Photoimmunol Photomed，2020，36（2）：111-117.[6]Yang C，Han LO.Knockdown of Beclin 1 inhibits vitamin K3 induced autophagy， but promotes apoptosis of human hepatoma SMMC-7721 cells[J].Mol Med Rep，2010，3（5）：801-807.[7]Guo Y，Zhang X，Wu T，et al.Autophagy in skin diseases[J].Dermatology，2019，235（5）：380-389.[8]Zhao Y，Zhang CF，Rossiter H，et al.Autophagy is induced by UVA and promotes removal of oxidized phospholipids and protein aggregates in epidermal keratinocytes[J].J Invest Dermatol，2013，133（6）：1629-1637.[9]Song X，Narzt MS，Nagelreiter IM，et al.Autophagy deficient keratinocytes display increased DNA damage， senescence and aberrant lipid composition after oxidative stress in vitro and in vivo[J].Redox Biol，2017，11：219-230.[10]Qiu Z，Kuhn B，Aebi 。