阿昔莫司对高棕榈酸饮食诱导的动脉粥样硬化的影响.pdf

目录1阿昔莫司对高棕榈酸饮食诱导的动脉粥样硬化的影响⋯⋯11 ．1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l1 ．2英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41 ．4材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 11 ．5结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OQ0000 ⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··2 01 ．6讨论⋯⋯··⋯⋯⋯⋯·O000QO000000 0 00 ⋯····⋯⋯····⋯⋯⋯⋯⋯·3 01 ．7结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 61 ．8参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 71 ．9英汉缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 22致{ 射·········⋯········⋯······⋯⋯····⋯⋯⋯⋯··⋯⋯⋯·······4 33游离脂肪酸与动脉粥样硬化( 综述) ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4 44攻读硕士学位期间发表论文及参与科研项目⋯⋯⋯⋯⋯⋯5 4阿昔莫司对高棕榈酸饮食诱导的动脉粥样硬化的影响摘要㈣㈣㈣㈣必Y 2 3 8 5 12 0背景：目前，大量研究表明饱和脂肪酸( s a t u r a t e df a t t ya c i d s ，S F A ) 与增加的心血管疾病风险相关。

其中，体内高水平的非酯化脂肪酸( n o n ．e s t e f i f i e df a t t ya c i d s ，N E F A ) 即游离脂肪酸( f r e ef a t t ya c i d ，F F A ) ，能够增加全因死亡率，尤其是心血管疾病的死亡风险棕榈酸是饮食中富含的一种与氧化应激和炎症有关的饱和长链脂肪酸然而，棕榈酸在动脉粥样硬化斑块进展及其斑块稳定性中的作用尚未被阐明阿昔莫司( a c i p i m o x ) ，化学名为5 一甲基吡嗪一2 一羧酸一4 一氧化物，是一种烟酸衍生物它能够抑制脂肪分解并减少脂肪组织释放游离脂肪酸已有研究证明阿昔莫司可减轻接受利托纳韦治疗的合并脂肪萎缩和高脂肪酸血症的L D L R 缺陷小鼠体内的动脉粥样硬化此外，我们先前的研究也表明阿昔莫司可抑制高油酸饮食诱导的载脂蛋白E ( a p o l i p o p r o t e i nE ，A p o E ) 基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块进展但阿昔莫司对高棕榈酸饮食A p o E 基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块进展以及斑块稳定性的作用尚不清楚目的：本研究选用A p o E 基因敲除( a p o l i p o p r o t e i nE —d e f i c i e n t ，A p o E 乒) 小鼠为研究对象，旨在探讨高棕榈酸饮食对动脉粥样硬化及其斑块稳定性的影响，并明确采用阿昔莫司治疗能否减轻高棕榈酸饮食诱导的此种作用。

方法：将6 —8 周龄的健康雄性A p o E 乒小鼠随机分为给予普通小鼠饲料的对照组( C o n t r o lg r o u p ，n = 1 0 ) ，给予含5 ％棕榈酸饲料的高棕榈酸饮食组( P a l m i t a t eg r o u p ，n = 1 0 ) 和给予含5 ％棕榈酸、0 ．0 2 ％1 阿昔莫司饲料的阿昔莫司干预组( A c i p i m o xg r o u p ，n = 1 0 ) 进行饲养，自由摄取自来水，干预1 2周后检测如下指标：1 ．采用比色法测定血浆甘油三酯( T G ) 、总胆固醇( T C ) 、低密度脂蛋白胆固醇( L D L ．C ) 、高密度脂蛋白胆固醇( H D L —C ) 和游离脂肪酸( F F A )浓度；2 ．采用大体油红染色观察降主动脉粥样硬化进展情况；石蜡切片H E染色观察主动脉根部动脉粥样硬化斑块情况；3 ．采用石蜡切片M a s s o n 染色检测主动脉窦部斑块内胶原沉积情况；4 ．采用免疫组化法检测主动脉基质金属蛋白酶( M ^ 口) 2 、3 、9 、1 4以及组织抑制因子( T I Ⅷ) 1 、2 的表达。

结果：1 ．实验结束后，饮食干预各A p o E 4 小鼠血浆T G 、T C 、L D L - C 、H D L —C水平无明显差异高棕榈酸饮食组与对照组相比血浆F F A 水平显著升高( P2 2 ) ；根据饱和度的不同可分为饱和脂肪酸( s a t u r a t e df a t t ya c i d ，S F A ) 、单不饱和脂肪酸( m o n o u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，M U F A ) 和多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，P U F A ) ‘4 1 S F A 主要包括棕榈酸和硬脂酸；M U F A 主要包括油酸；P U F A 主要包括亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等人体所含的脂肪酸大多都是长链脂肪酸脂肪酸碳链的长短及饱和度的差异直接影响其组成物的理化性质，从而引起生理功能的变化已有证据表明∞．3 长链多不饱和脂肪酸对心血管有保护作用[ 5 1 ，而S F A 可增加心血管疾病风险网但目前F F A 在动脉粥样硬化中的作用及其机制尚不清楚。

M U F A 不引起致动脉粥样硬化的血脂改变，被认为对心血管有保护作用【7 ’9 】然而，我们近期的研究表明油酸可诱导血管平滑R肌细胞泡沫化，加重载脂蛋白E 基因敲除( a p o l i p o p r o t e i nE —d e f i c i e n t ，A p o E 小)小鼠动脉粥样硬化损伤‘1 0 】棕榈酸是饮食中富含的一种饱和长链脂肪酸，有证据表明它与氧化应激和炎症有关‘1 1 ，1 2 】然而，棕榈酸在动脉粥样硬化形成及斑块稳定性中的作用目前尚不清楚阿昔莫司，化学名为5 一甲基吡嗪．2 一羧酸．4 氧化物，是一种烟酸衍生物，它能够抑制脂解作用并减少脂肪组织释放游离脂肪酸‘1 3 】，不仅具有良好的调脂作用，而且具有一定的抗动脉粥样硬化作用【1 4 1 我们前期的研究也表明阿昔莫司能够减轻高油酸饮食诱导的A p o E 4 小鼠体内的动脉粥样硬化【1 0 】但阿昔莫司对高棕榈酸饮食诱导的动脉粥样硬化及其斑块稳定性的影响目前尚不明确近年来，大量研究表明急性冠状动脉综合征( a c u t ec o r o n a r ys y n d r o m e ，A C S ) 等急性心血管事件的发生与不稳定斑块的形成和破裂关系密切，而与粥样斑块所致管腔狭窄程度无直接关系m ，1 6 1 。

胶原是动脉粥样硬化斑块细胞外基质中的重要组成部分，已被证明在维持动脉粥样硬化斑块纤维帽的完整性和斑块稳定性中有着重要作用‘1 7 】基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e ，M M P ) 能够水解胶原蛋白基质，被认为是斑块稳定性的重要调节因子‘1 8 ，1 9 】；基质金属蛋白酶组织抑制因子( t i s s u ei n h i b i t o ro f m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e ，n 御) 是M M P 的内源性抑制剂，可抑制M M P 的活性二者在维持细胞外基质的动态平衡中起着重要作用，并参与A S 血管重构和不稳定斑块的形成【2 0 1 因此，我们推测棕榈酸和阿昔莫司可能通过调节M M P ／T I M P 的平衡影响动脉粥样硬化斑块的稳定性A p o E ‘小鼠是能在正常饮食条件下自发性产生动脉粥样硬化的第一个小鼠模型，可观察到从脂质条纹到有纤维帽覆盖的成熟斑块等各个阶段动q脉粥样硬化的进展情况，并且与人类动脉粥样硬化斑块极为相似，是目前研究动脉粥样硬化的理想动物模型Ⅲl 。

因此，本研究选用A p o E 乒小鼠为研究对象，以高棕榈酸饮食和阿昔莫司为干预手段，分别观察高棕榈酸饮食和加用阿昔莫司治疗对血脂、F F A 水平、动脉粥样硬化斑块面积、斑块内胶原含量和血管M M P ／T I M P 表达的影响，以期明确高棕榈酸饮食对动脉粥样硬化及其斑块稳定性的影响，并明确采用阿昔莫司治疗能否减轻高棕榈酸饮食诱导的此种作用，并探讨其可能的分子机制材料与方法1实验材料与仪器选用遗传背景为C 5 7B L ／6 J 的雄性A p o E 基因敲除小鼠3 0 只，6 —8 周龄，购自南京大学模型动物研究中心动物被安置于成都医学院S P F 实验动物中心，采用标准的昼夜采光( 1 2 h 明／1 2 h 暗) 、温度( 1 9 ．2 6 ℃) 、湿度( 5 0 —6 0 ％) 的饲养条件，自由进食水实验过程由医院动物管理和使用委员会批准2 主要实验试剂及配制1 ．戊巴比妥钠( 上海索莱宝生物科技有限公司) ；2 ．肝素钠注射液( 河北常山生化药业有限公司) ；3 ．棕榈酸( S i g m a ，美国)4 ．阿昔莫司( S i g m a ，美国)5 ．T C 检测试剂盒( 北京北化康泰试剂有限公司) ；6 ．T G 检测试剂盒( 北京北化康泰试剂有限公司) ；7 ．H D L —L 检测试剂盒( 北京北化康泰试剂有限公司) ；8 ．L D L ．L 检测试剂盒( 北京北化康泰试剂有限公司) ；9 ．游离脂肪酸测定试剂盒( 南京建成科技有限公司) ；l O ．兔抗小鼠M M P ．1 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 1 ．兔抗小鼠M M P ．2 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 2 ．兔抗小鼠M M P ．3 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 3 ．兔抗小鼠M M P ．9 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 4 ．兔抗小鼠M M P ．1 4 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 5 ．兔抗小鼠T I M P ．1 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 6 ．兔抗小鼠T I M P ．2 抗体( 武汉博士德生物工程有限公司) ；1 7 ．油红O ( s i g m a ，美国) ；18 ．异丙醇( 成都科龙化工试剂厂) ；1 9 ．苏木素染液( 北京中杉生物技术公司) ；2 0 ．水性伊红染液( 北京中杉生物技术公司) ；2 1 ．碳酸锂( 上海生工生物工程有限公司) ；2 2 ．盐酸( 重庆川江化学试剂厂) ；2 3 ．二甲苯( 成都科龙化工试剂厂) ；2 4 ．乙醇( 成都科龙化工试剂厂) ；2 5 ．无水乙醇( 成都科龙化工试剂厂) ；2 6 ．氯化钠( 成都科龙化工试剂厂) ；2 7 ．磷酸氢二钠( 上海生工生物工程有限公司) ；2 8 ．枸橼酸三钠( 上海生工生物工程有限公司) ；2 9 ．枸橼酸( 上海生工生物工程有限公司) ；3 0 ．磷酸二氢钠( 上海生工生物工程有限公司) ；3 1 ．3 0 ％过氧化氢( 重庆市化玻公司) ；3 2 ．S A B C 免疫组化试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司) ；3 3 ．D A B 显色试剂盒( 武汉博士德生物工程有限公司) ；3 4 ．中性树胶( 中国上海标本模型厂) ；3 5 ．多聚甲醛( 成都科龙化工试剂厂) ；3 6 ．快速M a s s o n 染色液( 南京建成科技有限公司) 。

3 主要实验仪器1 ．电子称( S a r t o r i o u s ，德国) ；2 ．恒温鼓风干燥箱( 上海柏欣仪器设备厂) ；3 ．台式离心机( T h e r m oS c i e n t i f i c ，美国) ；4 ．．8 0 ℃超低温冰箱( 三洋电机，日本) ；5 ．去离子水过滤器( M i l l i p o r e ，德国) ；6 ．全自动脱水机( T h e r m oS c i e n t i f i c ，英国) ；7 ．石蜡包埋机( T h e r m oS c i e n t i f i c ，英国) ；8 ．石蜡切片机( T h。