病原菌分离培养总结.doc

病原菌的分离培养措施一、 基本原理　植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件规定不同,而供应它们合适的生活条件，即让病原菌生活在合适的培养基上,或加入某种克制剂导致只利于此菌生长,而克制其她菌生长的环境,从而得到纯菌株植物病原真菌的分离措施重要有组织分离法和稀释分离法两种最常用的措施是组织分离法，而稀释分离法重要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化,纯化的措施类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法二． 病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）1. 分离的准备工作（1）分离材料准备:花生褐斑病叶片:病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色,淡黄色晕圈背面有许多黑色小点,呈同心轮纹状排列2)培养基的准备: PDA培养基,加热熔化,紫外灭菌后倒板； Ø（３)分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1%升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）2. 组织分离法 （1） 工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用7０%酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时,呼吸要轻，不要说话。

2） 酒精灯放入中间合适位置,点燃后不要在移动,保证火焰周边无菌环境;（3） 取花生褐斑病的症状典型病叶(或其她分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边沿（病健交界处)切取小块病组织数块选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会腐生菌一般在发病好久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离4） 表面消毒：用菌培养皿一次准备流程(75％酒精—0．1％升汞—无菌水—无菌水—无菌水)，将病组织放人70％酒精中浸3—５s后，按无菌操作法将病组织移人0.1%升汞液中分别表面消毒1 miｎ左右(如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中持续漂洗三次，除去残留的消毒剂5） 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放3－５块在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近浮现细菌污染)6） 将培养皿倒置放人２5 ℃左右恒温箱内培养一般3—4ｄ后观测待分离菌生长成果;若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌7） 除根据菌落的一致性初步拟定长出的菌落与否目的菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的成果进一步拟定；（8） 在无菌条件下,用打孔菌落边沿挑取小块移入培养基上，在２5℃左右恒温箱内培养，数后来，观测菌落生长状况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可保存。

三． 病原细菌的分离培养(萝卜黑腐病为例)1.分离的准备工作（1)分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害重要危害叶和根幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂叶片发病,叶缘多处产生黄色斑，后变"Ｖ"字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变;横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色;重者呈干缩空洞,维管束溢出菌脓,这一点与缺硼引起的生理性变黑不同2)培养基的准备:PＤA,后划线纯化NB；（3）分离工作仪器与用品:超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70%酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等２.黑腐病菌分离(１)工作前用肥皂洗手,无菌操作前还要用7０%酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话２)酒精灯放入中间合适位置,点燃后不要在移动，保证火焰周边无菌环境；(3)取萝卜黑腐病块茎，用7５ %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块(2ｍm*３mm）,用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放3-5块。

在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近浮现细菌污染)4）将培养皿倒置放人28 ℃左右恒温箱内培养一般3—4d后观测待分离菌生长成果;若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌5）根据菌落的一致性初步拟定长出的菌落，选择长出的三种菌落（黄、红、生防)，分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在２8℃左右恒温箱内培养,数经培养后浮现的菌落在形态特性都趋于一致，并与典型描述的特性相一致时,即表白已获得纯培养;最佳要通过持续三次单菌落的分离，才干保证纯化6)观测到的菌落特性:萝卜黑腐病菌，圆形,同心环状，内环呈金黄色,外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷,半透明,边沿不整洁四．资料查询其她分离培养措施１.病原真菌稀释分离法　　（1)取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名ﻫ 　（２）用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0．5~1.0mｌ　　(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一种培养皿中的灭菌水混合，再从第一种培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中　　(4)将熔化开冷却到45~50C的培养基，分别倒在三个培养皿中(为避免细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入１-2滴２5%乳酸）,摇匀,凝固，要使培养基与稀释的菌液充足混匀。

　 提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板,而成为起伏不平的表面，不利于分离为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上,如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50C　 (５)将培养皿翻转后置恒温箱(２5℃)中培养,数后来观测菌落生长状况ﻫ （6)挑菌将培养后长出较为整洁一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置2５℃左右培养待菌长出后,检查菌与否单纯,若有其她菌混杂，就要再一次进行分离纯化,直到获得纯株培养2．病原细菌病原细菌的分离措施以稀释分离法和划线分离法为最常用在进行分离之前，一方面应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即通过镜检确认有喷菌现象后来，才对该病组织作分离工作稀释分离法是最典型的原则分离法，措施同上述真菌分离 　除去上述稀释分离法以外，较为以便的是划线分离法： (1）预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30C恒温箱中2—４ｈ,使表面无水滴凝结也可凝成平板后直接使用ﻫ 　(2)将病组织先用0．1%升汞表面消毒0.5--２min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡２0—60miｎ,让细菌释放到灭菌水中。

　　(3）用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线灭菌后再划第三次线 　提示:划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一环节非常重要,这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大　 (4）用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿,放在26～28C恒温箱中培养1—3d后观测有无细菌生长,在哪些地方有单菌落生长出来？其中的优势单菌落应为待分离菌形成的 (5）仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上同步,再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后浮现的菌落在形态特性都趋于一致,并与典型描述的特性相一致时,即表白已获得纯培养最佳要通过持续三次单菌落的分离,才干保证纯化五．　常用的几种典型的病原菌分离措施 1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织,在70%酒精中浸数秒钟后,移人０.１%的升汞水溶液中解决3—5raｉｎ，以灭菌水冲洗３次,移置培养皿的培养基中,然后培养　　2.维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用７０%酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

ﻫ　 ３.根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法ﻫ 4.肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待浮现症状后，用此法再行分离　 5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉），用灭菌水洗涤后,移置培养基上ﻫ 6.孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之 　7．土壤带菌分离法为了研究某些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的分离措施是将土壤取出少量，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。