AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能分析.docx

    AtJAR1基因在拟南芥耐盐性中的功能分析    李丹丹，林 蓉，李新国，郑月萍（1. 浙江农林大学 现代农学院，浙江 杭州 311300；2. 浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州311300；3. 山东省农业科学院 农作物种质资源研究所，山东 济南 250100）近年来，全球气候变暖，降雨量减少以及不适当的灌溉，导致干旱以及半干旱地区土壤盐渍化愈加严重，土壤盐渍化成为全球农业生产中面临的重大难题[1-2]目前，中国可耕地面积中约1/5的盐渍化土地，总面积高达0.98亿hm2[2]中国是世界人口大国，人均耕地面积不足0.1 hm2，如何利用盐渍化的土地，促进粮食产量的增加是艰巨的课题[3]，因此，研究植物的耐盐性和生理机制，筛选及培育耐盐作物品种成为农业研究领域的热点之一在长期的进化过程中，植物进化出多种应对盐胁迫的防御机制，其中报道较多的主要有4种：①渗透调节平衡机制分为有机渗透调节和无机渗透调节无机渗透调节是植物细胞通过吸收钠离子(Na+)和钾离子(K+)等无机离子作为渗透调节剂，将Na+在细胞内区隔化，从而使根和地上部积累较多的Na+，但不会出现明显的毒害症状[4-6]。

有机渗透调节则是指植物通过自身合成并积累一些可溶性无毒的有机小分子物质，如糖类、氨基酸类和甜菜碱等来维持细胞渗透平衡[7-8]如盐胁迫下，苹果Malus pumila通过积累可溶性有机溶质和无机盐离子来降低胞内渗透势[9-10]，番茄Lycopersicon esculentum叶片中可溶性糖含量升高[11]②离子的区域化与pH调节机制植物细胞利用跨膜运输将Na+和K+等无机离子转运至液泡中，使之与细胞质隔绝，降低渗透势，避免细胞器遭受毒害[12]同时，植物自身可以分泌有机酸从而调节根细胞中的pH稳态，缓解盐胁迫对根系的毒害[13]③抗氧化防御系统机制在高盐胁迫下，植物细胞质膜因受到水分胁迫或者离子胁迫而受损，从而导致脂质过氧化，使细胞内积累大量的活性氧，当积累的活性氧超过了细胞自身的清除能力就会对细胞造成损伤[8,14-15]在长期的进化过程中，植物自身会产生活性氧清除系统，包括一些抗氧化酶类等抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等，它们是衡量植物抗逆性的重要指标[6,16-17]④内源激素和信号转导途径研究发现植物内源激素在盐胁迫反应中起着重要作用，如脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)等[18-20]。

同时，蛋白激酶途径、ABA途径(ABA依赖型、ABA不依赖型)、盐超敏感(SOS)途径等[21-24]信号转导途径也参与了植物对盐胁迫的响应，并在其中发挥重要作用植物激素信号调控网络是植物应对各种非生物胁迫所必须的[25]茉莉酸(jasmonic acid，JA)作为重要的植物逆境激素在调控植物耐盐性方面发挥着重要的作用耐盐水稻Oryza sativa品种内源茉莉酸含量高于盐敏感品种，外源茉莉酸甲酯处理能够提高水稻幼苗耐盐性和大豆Glycine max幼苗对盐胁迫的抗性[26-27]盐胁迫下，水稻JA信号调控基因OsJAZ9与OsbHLH062互作介导离子稳态或通过增强抗氧化能力，从而增加对盐胁迫的耐受性[28-29]；内源茉莉酸通过维持番茄体内活性氧稳态来提高番茄的耐盐性[30]但是，目前关于JA信号如何调控植物的耐盐性仍鲜有报道茉莉酰氨基酸结合物合成酶(jasmonoyl amino acid conjugate synthase，JAR1)催化JA形成JA-Ile，AtJAR1基因发生突变后可导致JA信号传递中断因此，本研究运用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建拟南芥Arabidopsis thaliana AtJAR1基因突变体，并考察突变体对盐和ABA胁迫下的种子萌发和根系生长影响，以及盐胁迫下突变体对K+的吸收转运和AtHAK5表达量的影响，从而解析JA信号通路在植物耐盐性中的可能生理机制。

1 材料与方法1.1 AtJAR1基因突变体的构建1.1.1 CRISPR/Cas9载体的构建及拟南芥的遗传转化 CRISPR/Cas9靶序列的设计和载体的构建参照WANG等[31]和朱丽颖等[32]的方法以拟南芥茉莉酰氨基酸结合物合成酶AtJAR1为靶基因，选取鸟嘌呤和胞嘧啶含量高、特异性较强的2个关键片段作为靶序列，获得双靶点CRISPR/Cas9基因编辑载体以哥伦比亚野生型拟南芥为材料，使用农杆菌Agrobacterium tumefaciens侵染法进行拟南芥遗传转化[33-34]1.1.2 突变体的筛选 CRISPR/Cas9编辑载体具有mCherry荧光蛋白报告基因，因此，本研究参考朱丽颖等[32]的方法，挑选T1代转基因阳性种子，提取转基因阳性植株的基因组DNA，在目标基因靶序列2端设计引物进行PCR扩增(约200 bp)，利用质量浓度8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1)对PCR产物进行检测[32]1.2 地上部生物量测定取播种后21 d的植株整个地上部，称其鲜质量每个株系设置5个生物学重复，用单因素方差分析对株系间的差异显著性进行分析。

1.3 种子萌发试验1.3.1 种子消毒 1 mL 体积分数为75%乙醇溶液清洗3 min，弃乙醇加入1 mL 体积分数为35%的漂白水和体积分数为0.05% 吐温20混合溶液，轻轻摇晃混匀5 min，弃混合溶液；最后加入1 mL灭菌超纯水，清洗5次，置于4 ℃避光春化2 d1.3.2 氯化钠(NaCl)和脱落酸(ABA)培养基的配制 在1/2 MS植物培养基上添加不同浓度NaCl，分别配成0、75、100、125 mmol·L-1NaCl的1/2 MS植物培养基将ABA溶于体积分数为70%的乙醇中，配置成25 mmol·L-1的母液，参考STASWICK等[35]的浓度用体积分数为70%的乙醇进行稀释，分别配成含0、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00 μmol·L-1ABA的1/2 MS植物培养基1.3.3 种子萌发率统计 将消毒后的种子均匀点在添加有不同浓度NaCl(0、75、100、125 mmol·L-1)和ABA (0、1、5、10、20 μmol·L-1)的1/2 MS植物培养基上，置于22 ℃、14 h光照/10 h黑暗的温室中培养隔24 h统计1次萌发率，连续6 d，以拟南芥胚根穿透种皮时即认定萌发。

每个浓度重复3次萌发率=试验时间(d)的萌发种子总数/供试种子总数×100%1.4 幼苗耐盐性和ABA耐受性分析将消毒春化后的种子单粒点于1/2 MS植物竖直培养基上，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗的条件下竖直培养5 d后，移栽在添加不同浓度NaCl(0、50、100 mmol·L-1)和ABA(0、0.25、0.50、1.00 μmol·L-1)的1/2 MS植物竖直培养基上，继续培养7 d，以根长来评估它们的生长状况1.5 植物组织中K+和Na+质量摩尔浓度的测定1.5.1 幼苗培养及处理 将1/2 MS植物培养基上生长7 d幼苗，移栽至装有1/5 Hoagland培养液的蓝色花盆中(配方见表1)，培养14 d后对每个株系分别进行盐处理和对照处理盐处理更换外源添加50mmol·L-1NaCl的培养液，在处理0和24 h时，分别取每个株系的根部样品用于基因实时表达量的检测处理2 d后，将每个株系的地上部和根部用去离子水润洗后分别转入做好标记的信封中，放入恒温60 ℃烘箱连续烘6 h以上进行杀青1.5.2 样品消解及稀酸溶液的制备 将待测样品研磨后，称取50 mg左右样品用称量纸送至洁净干燥的消解管底部，每个样本设置3次生物学重复，依次加入7 mL浓硝酸、1 mL 质量分数为30%的过氧化氢水溶液，室温放置2 h，最后放入微波消解仪消解。

利用石墨赶酸仪于190 ℃下蒸发反应液至2 mL左右冷却后将反应液倒入离心管内，用超纯水将反应液定容至15 mL1.5.3 消解液中钾和钠质量摩尔浓度的测定 使用钾和钠的氯化物分别配制标准曲线离子的质量浓度梯度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 mg·L-1利用原子吸收光谱法测定K+和Na+的质量摩尔浓度1.5.4 植物组织中K+和Na+质量摩尔浓度的计算 具体的计算公式如下：C= [(Cn-C′) × 0.015/(M×10-3)]/m其中：C为1 g干物质样本中该离子的物质的量(μmol·g-1)；Cn为各样品消解液中该离子的质量浓度(mg·L-1)；C′为空白对照消解液中该离子的质量浓度(mg·L-1)；M为待测元素的相对分子量(g·mol-1)m为样品的干物质质量(g)1.6 相关基因的表达分析采用Trizol法提取拟南芥根中总RNA，之后进行基因组DNA的去除、反转录，以反转录后的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测基因的相对表达量从拟南芥信息资源库中查找以编码拟南芥肌动蛋白基因Actin2为内参基因，根据已知的AtVSP1、AtVSP2和AtHAK5基因(Gene ID:AT5G24780、AT5G24770和AT4G13420)序列，设计qRT-PCR引物(表2)。

采取2-ΔΔCt法计算待测基因的相对表达量表 1 1/5 Hoagland水培培养液配方Table 1 1/5 Hoagland formula for hydroponic culture solution表 2 相关引物序列Table 2 Sequence of related primers2 结果与分析2.1 AtJAR1基因突变体的获得及表型分析2.1.1AtJAR1基因突变体基因型的分子鉴定 在早期的基因功能研究中，常采用反向遗传学手段，构建基因突变体因技术水平的限制，前人构建突变体的方法多为化学诱变法然而，这种方式构建的突变体多只在目标基因发生点突变，使氨基酸残基发生变化，基因功能未必完全丧失例如，有研究发现：使用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变创建的ATS1基因突变体存在严重的基因渗透现象[36]因此，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建AtJAR1功能完全丧失型突变体经多代筛选鉴定，从转基因后代中获得了2个纯合突变体，分别将其命名为jar1-3-5和jar1-6-2对其靶位点附近序列进行测序分析，结果表明：jar1-3-5和jar1-6-2突变体在第2个靶位点，即第3个外显子处，分别发生了16和11 bp缺失的突变(图1)，导致编码序列(CDS)发生了相应变化，氨基酸序列发生移码突变。

在转录后翻译过程中，jar1-3-5的第111位氨基酸残基由丝氨酸突变为异亮氨酸(I)，并在继续错误翻译12个氨基酸(SGTSQGRPKFIP-KAVQSLFLSLMN)后，引入终止密码子UAA，提前终止翻译；jar1-6-2的第113位氨基酸残基由甘氨酸突变为精氨酸，并在继续错误翻译8个氨基酸(TSQGRPKF-PSKVYSFH)后，引入终止密码子UGA，提前终止翻译因此，构建的突变体可判断为功能完全丧失型突变体图 1 jar1-3-5和jar1-6-2突变序列信息Figure 1 Sequence information of jar1-3-5 and jar1-6-2 mutants2.1.2AtJAR1基因突变体表型分析 将筛选的突变体(jar1-3-5和jar1-6-2)和野生型种子进行播种，在生长前期观察并比较两者的表型差异结果显示：前21 d时，突变体植株可以正常生长，甚至其地上部明显大于野生型进一步对生长21 d的植株地上部生物量进行统计分析发现：突。