一次大强度耐力运动对大鼠骨骼肌蛋白质降解和AMPK活性变化的影响-耐力训练可主要增强骨骼肌.docx

一次大强度耐力运动对大鼠骨骼肌蛋白质降解和AMPK活性变化的影响|耐力训练可主要增强骨骼肌 　　摘要：为探讨一次大强度耐力运动过程中，AMPK活性变化对骨骼肌蛋白质降解的作用将36只 SD大鼠进行一次跑台运动，坡度5%，运动强度25 m/min，运动时间60 min取样为运动前、运动0.5、1 h，运动后1、2、6 h等6个点使用高效液相色谱法测定AMP、ATP质量摩尔浓度；采用同位素技术测定腓肠肌中AMPK活性的变化；采用荧光定量PCR技术，测定腓肠肌中MuRF1、MAFbx基因表达量的变化结果发现：(1)运动0.5 h到运动后即刻，AMP质量摩尔浓度及AMP与ATP质量摩尔浓度比值升高(P 　　Key words: exercise biochemistry；AMPK；MAFbx；MuRF1 mRNA；protein degradation；rat；AMP 　　　　　　泛素蛋白酶体系统是一个主要的蛋白质降解系统，对动物的研究逐渐显示：在肌肉萎缩过程中，泛素蛋白酶体系统促使蛋白质降解Muscle Ring Finger 1(MuRF1)和Atrophy F-box(MAFbx也称为Atrogin-1)均属于泛素蛋白连接酶，是目前发现的与骨骼肌蛋白质分解代谢关系最为密切的泛素蛋白连接酶。

有报道在制动、去神经、后肢悬吊、饥饿以及病理情况(糖尿病、肿瘤、脓毒症)下，骨骼肌萎缩的模型中，MuRF1、MAFbx表达量均明显增高[1-3]目前研究认为MuRF1和MAFbx是骨骼肌蛋白质降解的标志测定其表达量的变化可反映骨骼肌蛋白质的降解情况　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)在真核细胞生物中广泛存在，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶骨骼肌中AMP含量升高是促进AMPK激活的主要因素有报道机体在缺氧、缺血以及葡萄糖缺乏等情况下可激活哺乳动物细胞中的AMPK，其原因也是由于提高了AMP含量、AMP与ATP的比值，促进了AMPK的激活关于运动对AMP含量的影响，有资料显示随着运动强度的增加，AMP与ATP比值呈波动性上升趋势[4]　　2022年，Thomson[5]研究报道AMPK可能抑制骨骼肌蛋白质的合成，其采用老年大鼠和成年大鼠为实验对象，进行机械刺激促使大鼠肌肉肥大，观察到随着年龄增大，大鼠快肌肥大情况随之下降，快肌中AMPK活性反而增加；大鼠慢肌纤维随着年龄增大，肥大情况没有差异，慢肌中AMPK的活性也没有差异研究者认为年龄造成AMPK活性的升高可能是造成快肌肥大程度减弱的原因。

该研究观察到随着年龄增大大鼠快肌肥大情况随之下降，推测AMPK可能有抑制蛋白质的合成，或者有促进蛋白质降解的作用　　有报道在运动过程中，AMPK活性显著升高，能抑制蛋白质的合成[6]而关于AMPK活性升高促进骨骼肌蛋白质降解的研究较少，2022年有报道用5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(5-aminoimidazole-4-carboxamide　　ribonucleoside，AICAR)处理C2C12肌管，观察到基质中3-甲基组氨酸(3-methylhistidine，3-MH)含量升高和MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA的表达3-MH是一种微量氨基酸，主要存在于骨骼肌的肌动蛋白和肌凝蛋白内(约91.1％)，是收缩蛋白质分解代谢释放的产物，测定3-MH的释放量可间接反映肌纤维蛋白的降解因此，研究者认为AMPK活化刺激了C2C12肌管中肌纤维蛋白的降解[7]目前，还没有见到对一次大强度运动过程中，AMPK活性的升高对骨骼肌蛋白质降解的研究本研究拟采用大鼠进行一次性大强度耐力运动模型，探讨AMPK活性的变化，以及测定大鼠腓肠肌中MuRF1、MAFbx基因表达量的变化，探讨在一次大强度耐力运动过程中，AMPK对骨骼肌蛋白质降解的作用。

　　　　1材料　　　　1.1实验动物　　雄性Sprague-Dawley大鼠(SPF级)，8周龄，体重190~220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司动物实验经北京体育大学动物福利伦理审查委员会同意，并严格按照北京体育大学动物实验室规定执行屏障环境饲养，温度(23±2)℃，相对湿度(65±5)%，昼夜明暗交替时间为12 h每笼4只，自由饮食与饮水　　1.2动物分组　　36只大鼠分为6组，每组6只安静饲养3 d，以适应新环境跑台运动适应3 d(第1天10 min，10 m/min；第2天15 min，10 m/min，第3天15 min，15 m/min)，休息1 d，然后进行一次性大强度耐力运动(25 m/min，5%坡度)，除安静组不运动，运动0.5 h组运动时间为0.5 h外，其它组运动时间为1 h根据动物运动时间和取材时间分组为：安静(C)、运动0.5 h(T1)、运动1 h(T2)、运动后1 h(T3)、运动后2 h(T4)、运动后6 h(T5)　　1.3样品制备　　根据分组情况进行取材，大鼠称重后，用质量分数为2％戊巴比妥钠(注射剂量为100 g体重0.25 mL)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血后，迅速取等量的红、白腓肠肌，放入液氮中速冻保存。

取材完成后把标本转移至-80 ℃冰箱保存，待用　　　　2方法　　　　2.1骨骼肌AMP、ATP质量摩尔浓度的测定　　使用高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)测定AMP、ATP质量摩尔浓度　　样品前处理：用电子天平称取肌组织50 mg，用眼科剪剪碎后，加入0.5 mL质量分数0.9%NaCl溶液(内含0.5 mmol/L EDTA-2Na)和0.5 mL体积分数3% HClO4溶液，用电动匀浆器冰浴匀浆匀浆后，4 ℃下沉淀蛋白(静置时间不少于10 min)，3 000 r/min，4 ℃，离心10 min取上清液0.5 mL，加入质量分数20% KOH溶液40 μL，4℃静置30 min，11 000 r/min，5 min离心，取上清200 μL，-80 ℃保存待测　　分析条件：高效液相色谱仪(Agilent 1100 series，德国Agilent公司)，5 m，150 A反相柱(4.6 mm×150 mm) cat.NO：Vs951505-0流动相为磷酸钾缓冲液(50 mmo1/L KH2PO4)、甲醇和离子对试剂A的混合液(磷酸钾缓冲液和甲醇的体积比为76�24，混合液中离子对试剂A的浓度为5 mmol/L，最后调pH至5.8)，等比洗脱，流速为1 mL/min，检测波长259 nm。

柱温20 ℃，进样量20 L根据标准品浓度和其相应的积分面积绘制出标准曲线，再根据标准曲线，计算出各个样品的质量摩尔浓度　　2.2AMPK活性的测定方法　　方法与参考文献[8]同　　2.3用实时荧光定量PCR技术测定腓肠肌 MAFbx和MuRF1基因表达　　方法与参考文献[8]同　　2.4统计学处理　　数据以均数±标准差表示，采用SPSS统计软件包进行单因素方差分析以P 　　3.3一次大强度耐力运动各组MuRF1mRNA和MAFbx mRNA表达量的变化　　与安静组相比，运动0.5 h、1 h组MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表达量差异没有显著性；运动后2 h组MuRF1 mRNA、MAFbx mRNA表达量与安静组比较，差异有非常显著性(P 　　总之，本研究认为大鼠进行一次性大强度耐力运动，AMP质量摩尔浓度及AMP与ATP比值在运动中显著升高，在运动后迅速恢复AMPK活性在运动0.5 h后开始升高，持续到运动后6 h在大强度耐力运动后，AMPK活性升高可能对促进了MAFbx mRNA和MuRF1 mRNA的表达，促进了骨骼肌蛋白质的降解具有一定的作用。

　　　　参考文献：　　[1] Bolster D R，Crozier S J，Kimball S R，et al. AMP-activated protein kinase suppresses protein synthesis in rat skeletal muscle through down-regulated mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling[J]. J Biol Chem，2022，277(27)：23977-23980.　　[2] Wray C J，Mammen J M，Hershko D D，et al. Sepsis upregulates the gene expression of multiple ubiquitin ligases in skeletal muscle[J]. Int J Biochem Cell Biol，2022，35(5)：698-705.　　[3] Dehoux M J，Van Beneden R P，Fernández-Celemín L，et al. Induction of MaFBx and Murf ubiquitin ligase mRNAs in rat skeletal muscle after LPS injection[J]. FEBS Lett，2022，544(1-3)：214-217.　　[4] 洪平，赵鹏，杨奎生. 不同强度运动时大鼠骨骼肌能量代谢产物的变化[J]. 中国运动医学杂志，2022，21(3)：261-268.　　[5] Thomson D M，Gordon S E. Diminished overload-induced hypertrophy in aged fast-twitch skeletal muscle is associated with AMPK hyperphosphorylation[J]. J Appl Physiol，2022，98(2)：557-564.　　[6] 张国华. 不同运动骨骼肌AMPK的变化特点及对mTOR和下游信号的调控[D]. 北京：北京体育大学，2022.　　[7] Nakashima K，Yakabe Y. AMPK activation stimulates myofibrillar protein degradation and expression of atrophy-related ubiquitin ligases by increasing FOXO transcription factors in C2C12 myotubes[J]. Biosci Biotechnol Biochem，2022，71(7)：1650-1656.　　[8] 马延超，朱荣，许寿生，等. AMPK活化对骨骼肌中MAFbx mRNA、MuRF1 mRNA的表达和3-MH含量的影响[J]. 体育学刊，2022，17(8)：112-117.　　[9] Ai H，Ihlemann J，Hellsten Y，et al. Effect of fiber type and nutritional state on AICAR-and contraction-stimulatedglucose transport in rat muscle[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2022，282(6)：:E1291-1300.　　[10] Balon T W，Jasman A P. Acute exposure to AICAR increases glucose transport in mouse EDL and soleus muscle[J]. Biochem Biophys Res Com。