孤对电子杂环类环境污染物的微生物降解研究.pdf

东凡学博士学位论文摘要杂环化合物是指具有环状结构，并且除碳氢原子外，至少还含有一个杂原子的化合物本文研究的对象主要是含有硫、氮、氧三类杂原子的孤对电子杂环化合物这些杂环化合物是严重的污染源，化石燃料中的含硫、含氮化合物是在燃烧过程释放出大量的硫氧化物和氮氧化物，是酸雨的成因之一，对环境造成了严重的污染随着人类社会的发展，能源的消耗与日俱增，这些化合物造成的污染也越来越严重生物处理方法由于具有操作条件温和、费用低、对环境造成的二次污染少而受到越来越多的重视二苯并噻吩( D i b e n z o t h i o p h e n e ，D B T ) 是化石燃料中含有的一种典型的有机硫化合物，使用传统的加氢脱硫( H y d r o d e s u l f u r i z a t i o n ，H D S ) 难以去除，因此选择D B T 作为微生物脱有机硫反应的模式化合物石油中的含氮化合物主要是咔唑( C a r b a z o l e ，C A ) 的各种烷基衍生物，所以生物脱氮的研究是以C A 为模式化合物二苯并呋喃( D i b e n z o f u r m a ，D B F ) 是研究二恶英类( d i o x i n —l i k e ) 氧杂环环境污染物生物降解的模式化合物。

本工作使用实验室前期分离出来的一株降解D B T 的菌株X P 为研究对象菌株X P 为常温菌株，可以在3 0 C 左右降解含硫化合物对X P 菌株进行了菌种鉴定，X P 菌落生长初期形成短的分枝菌丝体，然后分化成球菌及棒杆菌的形态；菌落有光泽，从奶白色逐渐变为粉红色；X P 菌株的分枝菌酸属于红球菌分枝菌酸；脂肪酸类型为无分支，含有饱和及不饱和脂肪酸，同时还含有结核菌脂酸，与数据库中的红平红球菌脂肪酸类型有8 6 ．5 ％的同源性：x P 菌株的f i b o p r i n t 模式与模式菌株R h o d o c o c c u se r y l h r o p o l i sD S M4 3 0 6 6 1 相似；X P 菌株的1 6 Sr D N A序列在诊断区( 1 - 5 0 0 个碱基) 与模式菌株R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sD S M4 3 0 6 6 的1 6 Sr D N A 序列1 0 0 ％的同源通过上述常规的形态学、化学分析法( 包括脂肪酸、分枝菌酸分析) 和分子生物学结果( R i b o p r i n tp a t t e r n 和1 6 Sr D N A 序列的比对) ，最终确定X P 菌株属于红平红球菌，命名为R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sX P 。

红平红球菌( R h o d o c o c c u se ，y t h r o p o l # ) X P 可以利用各种硫源，包括部分甲基噻吩、甲基苯并噻吩及令部测试的二苯并噻吩类化合物为唯一硫源生长通过V孤对电子杂环类环境污染物的微生物降解研究G C ．M S 分析，检测了菌株x P 代谢D B T 的中I ' q 物及终产物结果表明，菌株代谢D B T 的终产物为2 ．羟基联苯( 2 - H y d r o x y b i p h e n y l ，2 - H B P ) ，同时检测到了巾间产物D B T 砜( D B Ts u l f o n e ，简称D B T 0 2 ) 说明x P 代谢D B T 走经典的硫专一性代谢途径，也称为“4 s ”途径详细考查了X P 菌株对D B T 在生长状态下的降解情况和2 - H B P 的生成情况发现x P 可以在生长体系下，4 8h 内降解0 ．4 5m M 的D B T 同时生成0 ．4 2m M 的2 - H B P ，说明红平红球菌( R h o d o c o c c u sP r y t h r o p o l i s ) x P 降解D B T 与2 - H B P 的生成是对应的。

同时分析了菌株x P 对3 一甲基苯并噻吩( 3 ．M e t h y l b e n z o t h i o p h e n e ，3 - M B T ) 和D B T 烷基取代物，如4 ·甲基D B T ( 4 - M e t h y l —D B T ，4 - M D B T ) 、4 , 6 - 二甲基D B T ( 4 , 6 - D i m e t h y l D B T ，4 , 6 一D M D B T ) 和萘并苯噻吩( B e n z o n a p h t h o t h i o p h e n e ，B N T ) 的代谢途径菌株x P 代谢4 - M D B T ，生成了2 ．羟基．3 ’一甲基联苯( 2 一h y d r o x y - 3 ’一m e t h y l b i p h e n y l ) 和2 ．羟基．3 ．甲基联苯( 2 一h y d r o x y 一3 一m e t h y l b i p h e n y l ) ；代谢4 , 6 一D M D B T 生成了2 一羟基一3 ，3 ’．二甲基联苯( 2 ．h y d r o x y 一3 ，3 ’．d i m e t h y l ．b i p h e n y l ) ；代谢B N T 生成了H 一羟基一D 一苯基．萘( 0 【．h y d r o x y —p —p h e n y l —n a p h t h a l e n e ) 。

菌株X P 对甲基苯并噻吩也有降解能力，代谢3 - M B T 生成2 一异丙基苯酚( 2 ．i s o p r o p e n y l p h e n 0 1 ) 通过代谢途径的分析发现，红平红球菌( R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) X P 降解噻吩类化合物走经典的硫专一性途径，生成相应的羟基苯／联苯类化合物为终产物采用红平红球菌X P 对柴油，原油和汽油进行了脱硫实验结果显示x P 菌株对初始硫含量为2 5 9p p m 的柴油可以达到9 4 ．5 ％的脱硫辛，高于已_ 垠道的生栉脱硫率，达到了深度脱硫的目标R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sX P 可以深度脱硫关键在于x P 菌株可以更好的降解燃油中甲基化程度更高的含硫化合物经生物脱硫催化剂作用后，柴油的烷烃没有显著的变化，说明该生物处理过程不损失燃烧值a 同时首次报道X P 菌株对原油有良好的处理效果，对初始硫含量为3 , 2 1 0p p m的抚顺原油有6 2 ．3 ％的脱硫率，对初始硫含量为1 , 2 3 7p P m 的苏丹原油有4 7 ．2 ％的脱硫率，说明X P 具有很大的应用潜力。

依据当前中国原油开采的实际情况，提出了采用生物法处理原油要比处理柴油更有实际应用价值本文还尝试了使用x P 休I E 细胞处理汽油，X P 休止细胞可以脱除催化裂化汽油中3 0 ％的硫；对直馏汽油处理效果明显，可以达到8 5 ％的脱硫率X PN 株x , j 含硫量较高的催化裂化汽油处理效果不理想，x P 更适用于以二苯并噻吩为主要含硫化合物的原油和山东大学博十学位论文柴油的生物脱硫根据已发表的脱硫基因序列的保守性，设计了引物，使用聚合酶链式反应( P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n ，P C R ) 扩增了红平红球菌X P 的脱硫基因d s z A B C 得到的转化子可以在2 4h 内将O ．5m M 的D B T 完全降解掉同时转化子对各种有机硫源都有较高程度的降解同样使用P C R 扩增的手段，得到R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sx P 的黄素还原酶D s z D 的基因序列，通过活力测定确认获得的基因为d s z D 通过上面成功的克隆了有活力的d s z A B C D 四个基因，进而测序，结果与模式菌株I G T S 8 的相关基因比对，d s z A B C 的基因序列与脱硫模式菌株t G T S 8的脱硫基因同源性超过9 9 ％；d s z D 基因与1 G T S 8 的同源性为9 8 ．5 ％。

使用重组P C R 的手段，获得了d l z A C 基因簇，将其导入表达载体p K K 2 2 3 —3 中，获得的转化予P K K A C 可以有效地降解D B T ，生成脱硫途径中的倒数第二个产物H P B S 同时转化子对其他各种甲基D B T 也有同样的攻击能力，降解各种D B T 类物质生成相应的C x —H P B S ，也直接证明了R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sX P 降解D B T 完全遵循报道的“4 s ”途径首次报道了将C A 降解基因导入D B T 降解菌株并获得成功将咔唑1 ，9 a 双加氧酶导入R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sX P 构建了重组菌株R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sS N 8 咔唑1 ，9 a 双加氧酶可以选择性的降解C A 生成2 ' - 氨基联苯一2 ，3 一二醇，从而可以减少对加氢处理的抑制构建的重组菌S N 8 可以选择性的降解D B T 和C A ，不损失燃烧值通过实验发现S N 8 可以同时降解水体系和正十四烷中的C A 和D B T 。

S N 8 可以在6h 内将体系内的D B T 和C A 全部降解掉，并且实验证实导入的c a r A 基因对D B T 的降解基本无影响进一步实验了S N 8 对原油中含硫含氮化合物的降解能力，S N 8 休止细胞可以有效地降解F S 4 8 0 0 原油中绝大部分的可检测含硫化合物，同时对原油中的咔唑，一甲基至三甲基取代的咔唑类化合物都有不同程度的降解能力此外，将负责编码降解C A 生成邻氨基苯甲酸酶系的基因c a r A B C 导入R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sx P 构建了重组菌株R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sX P D N 通过G C —M S 分析证实X P D N 可以降解D B T 生成D B T 0 2 到2 - H B P ，同时降解C A 生成邻氨基苯甲酸R h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i sX P D N 可以同时降解D B T 、C A 和二苯并呋喃( D i b e n z o f u r a n ，D B F ) 这三类杂环类化合物，并且可以继续降解2 - H B P 生成苯甲酸。

构建的重组菌株X P D N 可以V I I孤对电了杂环类环境污染物的微生物降觯研究降解这三类化合物生成无毒的产物，在环境修复t ：具有一定的价值X P D N 休止细胞还能够攻击二恶英前体物质d i b e n z o - p —d i o x i n ( D D ) ，在7d 之内可以完全降解掉0 ．1 m M 的D D 在微生物降解疏水化合物时，双液相系统有助于克服污染物的生物可利用性障碍，提高污染物的生物降解速率，因而在生物催化上大量使用然而，现在许多有机溶剂都是生物体毒素，甚至有些溶剂在极低的浓度( 0 ．1 ％v ／v ) 存在时也能杀死细胞同样燃油也同有机溶剂一样存在相同的生物毒性因此本工作也开展了将脱硫基因d s z A B C D 导入一株最高可以耐受5 0 ％C - 甲苯的恶臭假单胞菌，构建了能够同时脱硫和耐受有机溶剂的工程菌株构建的工程菌株。