羟基自由基的清除 docx.docx

西瓜汁清除羟基自由基的研究1 前言羟自由基(·OH)是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种生物大分子，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的一种活性氧自由基，与机体的衰老、肿瘤发生发展、辐射损伤和细胞吞噬有关[1]离体检测·OH 有多种方法，如电子自旋共振(ESR)法[2] 、高效液相色谱(HPLC)法[2]、化学发光法[4]、比色法[5]和荧光法[6]等因甲基紫分光光度法测 ·OH 所需设备简单，操作简便，试剂易得，测定快速，易为一般实验室所采用其基本原理是在最利于 Fenton 反应进行的 pH 下，溶液中的 Fe( )主要以 F(eOH)2 形式存在，呈络合态的亚铁离子能够比游离状态的离子更快地催化过氧化氢产生·OH，这可能是由于络合中间体降低了铁离子表面电荷，减小了水化半径，有利于电子的传递，从而加快了反应速率甲基紫在 pH 妻 3.10 的酸性溶液中呈紫色，而·OH 具有高反应活性，容易与甲基紫中具有高电子云密度的一 C=C一基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色，故通过测定甲基紫吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量闭。

大量的研究指出摄食水果和蔬菜丰富的饮食与某类癌症和其它疾病发病率的降低相关联[8,9]，可能的解释是水果蔬菜中的微量营养素具有抗氧化活性，可清除活性氧自由基，抑制由之导致的疾病发生发展西瓜汁多味甜，是广受欢迎的世界性水果，在我国栽培面积也很大西瓜不但可消暑止渴，还有防治病之功效最近美国心脏协会授权在西瓜产品上可以使用有利于心脏健康的标志“Heart Heatlhy”在对西瓜进行的深加工中，以生产西瓜汁为最多，已有不少报道研制出多种西瓜汁产品，西瓜汁的医用价值在受到人们的极大关注目前对各种天然产物清除轻自由基的研究已有很多，尽管有报道在极干旱条件下，野生西瓜叶子中积累高浓度的轻自由基有效清除剂瓜氨酸与诱导的类型一 2 金属硫蛋白CLMT2[10,11]，而有医用功效的西瓜汁之清除经自由基作用还未见有文献报道，更没有不同瓤色西瓜汁清除轻自由基的研究本文采用甲基紫分光光度法测定四种不同瓤色西瓜的汁对轻自由基的清除率，并通过石油醚萃取方法对西瓜汁中羟自由基的清除物进行探讨2、材料与方法2.1 仪器与试剂主要仪器 型号 生产厂家离心分离机 HIATCHI55P 一 72 日本 HIATCHI 公司 分光光度计 722S 上海精密科学仪器有限公司数字酸度计 PHS 一 25B 上海大普仪器有限公司H2O2(30%)、甲基紫、无水 FeSO4、三轻甲基氨基甲烷(Tris)、浓 HCI 浓 H2SO4 等均为国产分析纯; 二次蒸馏水为实验室自制。

2.2 实验材料不同瓤色的西瓜由中国农业科学院西瓜甜瓜中期库提供，其品种和瓤色如表 4.1. 表.41 西瓜品种瓤色表Table 4.1 List of watermelon with different bereds and colos中期库原号 中期库新号 品种名称代号 瓤色ZXG00214 ZXG00147 早花 红瓤ZXG00469 ZXG00140 红一号 桃红瓤ZXG00318 ZXG00318 30 超风 黄瓤ZXG00209 ZXG00879 三白瓜 白瓤2.3 实验方法2.3.1 ·OH 的测定 Fenion 反应是以 H2O2 为氧化剂，以 Fe2+为催化体系氧化法生成·OH 的反应，Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + OH- +·OH 所产生的 ·OH 与加入的指示剂甲基紫作用后可使其吸光度降低，通过测指示剂吸光值的变化可间接测定生成的·OH。

参照同类方[1，12]加以修改，操作如下，在一系列 10mL 带塞比色管中分别加入0.6mL 甲基紫溶液(5.0 x 10-4 mol/L)、1.0mLFe2+溶液(5.0 x 10-3 mol/L)、1.0 ML H2O2 溶液(0.12％) 和 1.4mL Tris-HCl 溶液(0.1mol/L,PH=8.2)，用二次重蒸馏水将反应液补充 10mL 并摇匀，在反应体系的最大吸收波长 入=578nm 处[1] 测定吸光度 A ，计算其与空白参比 A 之差△A 空白参比为二次重蒸馏水2.3.2 西瓜汁清除.OH 的测定 分别取表 4.1 列不同瓤色品种的成熟去籽瓜瓤 100g，捣碎，用纱布过滤，滤液经高速离心后取上清液用于清除·OH 测定在测定，OH 反应体系中加入一定量的西瓜汁后(反应体系总体积 10mL 保持不变)，然后测定反应体系吸光度As、未加西瓜汁的反应体系吸光度 A 、以及未加 Fenion 试剂及西瓜汁的空白参比吸光度A，按以下公式计算·OH 清除率 S : S =[ (As 一 A) / (A 一 A) ] x 100%2.3.3 西瓜汁经石油醚萃取后水相及醚相·OH 清除能力比较 使用成熟红瓤西瓜，取西瓜汁 100mL，用 30mL 石油醚萃取四次，分液后醚相经真空旋转蒸干，用甲醇溶解至100mL，用于清除·OH 能力测定，分液后的水相补足 100mL 后也用于测定其对·OH 清除能力。

3 实验结果3.1·OH 反应测定体系适宜条件的确定3.1.1 甲基紫、Fe2+及 H2O2 用量的影响 本测定法中甲基紫作为间接测定·OH 的指示剂，其在反应体系中加入量的多少对测定结果准确性影响很大由图 4.1A 可看到，随着甲基紫溶液(5.0 x 10-4 mol/L)加入量的增加，△A 值也相应增大，当加入甲基紫体积为0.6mL，即其在反应体系中的终浓度为 3.0 x 10-5 mo/L 时，△A 值趋于稳定，选择甲基紫的用量为 0.6mLFe2+作为产生·OH 反应的催化剂其用量必对测定结果有很重要的影响可看到其它条件不变，随着加入 Fe2+溶液 (5.0 x 10-3 mol/L)的量的增加，△A 值也缓慢地增加(图 4.1A)，在加入 1.0mLFe2+溶液时△A 值最大，则选择 Fe2+溶液用量为 1.0mL，即其在体系中终浓度为 5.0 x10-4 mol/L保持其它条件不变，即 3.0 x 10-5 mol/L 甲基紫与 5.0 x 10-4 mol/L Fe2+，△A 值随着加入 H2O2 溶液(0.12%) 的量的增加也相应变化 (图 4.1A)，加入的 H2O2 液 1.0ml 时△A 值最大，表明此时·OH 生成量最多，指示剂吸收差值也最大，本测定体系选择 HZOZ 液用量为1.0ml。

3.12 PH 的影响 保持以上反应条件，加入不同体积的 Tris-HCI 缓冲溶液(pH=8.2)，调节体系 PH 值在 3.0~6.0 范围，测定其△A 值，如图 4.1B 所示，反应体系 PH 对·OH 生成及与指示剂反应影响很大，PH=4.5 时△A 值最大，表明本体系适宜酸度为 PH=4.53.1.3 反应时间的影响 其他反应条件不变，每 5 min 取样测定一次吸光度，可看随着反应时间的增加，△A 值逐渐增大(图 4.1C)，但是增幅极小，综合考虑实验准确性、灵敏度与测定效率，选择反应进行到 30min 时测定其△A 值研究得到的最适反应体系条件为甲基紫浓度 3.0 x 10-5mol/L、Fe2+浓度 5.0 x 10-4 mol/L、0.12% H2O2 用量 1.0mL、pH=4.5、反应时间 30min、入=578mn，参照同类研究报道[1,12],本体系试剂加入顺序为:MV → Fe2+ → H2023.2 西瓜汁清除·OH 作用分别使用不同瓤色西瓜汁测定对·OH 的清除率，结果见表 4.2，同体积瓜汁对·OH的清除能力，红瓤瓜的稍强于桃红瓤瓜的，它们都很明显地强于黄瓤与白瓤瓜的。

清除率一西瓜汁体积(S-V)关系如图 4.2，可以看到，随着加入反应体系中西瓜汁体积的增加，对·OH 的清除率相应增加红瓤和桃红瓤西瓜汁的清除率曲线斜率较黄瓤和白瓤西瓜的大，显示出红瓤和桃红瓤西瓜汁对·OH 的清除能力大于黄瓤和白瓤西瓜汁的红瓤瓜汁的曲线斜率又稍大于桃红瓤瓜汁的，表明其·OH 清除能力稍强一些，但差别不如与黄瓤和白瓤西瓜汁比较的那样明显对黄瓤和白瓤西瓜汁，当加入体积在 0.1-0.5mL 时，其清除率随体积增加较快，曲线斜率较大，体系中加入的瓜汁体积继续增加，清除率也在增加，但曲线斜率增加幅度逐渐减小，到体积为 1.0~4.0mL 时，清除率几乎不再变化，曲线斜率很小此二者相比，黄瓤瓜汁的清除能力稍强于白瓤瓜汁的由之可见，各种不同瓤色的西瓜汁对·OH 均具有很强的清除能力，对 ·OH 的清除率均随着加入瓜汁体积的增加而增大，加入的体积相同时，不同瓤色西瓜汁对·OH 的清除率为 S 红 > S 桃红 > S 黄 > S 白 ，其清除率达到 50%时的体积分别为红色 0.76mL、桃红色0.80mL、黄色 1.50mL 和白色 3.65mL为了探讨西瓜汁可清除·OH 的原因，即其中对清除能力贡献大的成分的可能属性，对西瓜汁进行石油醚萃取，得到水相与醚相，再比较原瓜汁、水相与醚相对·OH 的清除能力，结果见图 4.3，可看出，原西瓜汁和经石油醚萃取后水相对·OH 清除率均随体积的增加而增大，水相的·OH 清除率接近原瓜汁的，只在 3mL 以下水相稍低于原瓜汁。

对甲醇溶解的醚相进行·OH 清除测定，保持测定体系其它条件不变，溶液中出现沉淀，说明反应生成的 Fe3+与 OH-形成 Fe(OH)3 沉淀，·OH 未能得到清除，表明醚相对·OH 的清除能力非常弱，几乎没有，可见西瓜汁对·OH 的清除作用中，水相的抗氧化剂发挥着主要作用，醚相的抗氧化剂作用能力极低4 讨论羟自由基(·OH)是一种在机体内危害作用最大的活性氧自由基，·OH 清除率是反映西瓜汁抗氧化能力的重要指标，研究西瓜汁·OH 清除能力，即认识西瓜对人的防病保健功能的机理，不仅会促进其功用的开发，还为西瓜的营养栽培以及营养育种提供理论依据本试验发现不同瓤色西瓜汁对·OH 都有一定的清除作用，瓤色不同清除能力不同，甚至差别很大，如红、桃红瓤瓜与黄、白瓤瓜已经知道存在于水果中可清除·OH 的成分有抗坏血酸、维生素 E、多酚类物质、类胡萝卜素等[13] ，从西瓜汁对 ·OH 清除率比较结果看，似乎瓤色是决定西瓜汁清除能力的关键，而引起西瓜瓤具有不同颜色的物质是存在的天然色素，既类胡萝卜素与花色素，前者是脂溶性的，也是西瓜瓤带色的主要原因，后者是水溶性的，在西瓜中含量低从本试验瓜汁分相结果看，水相的抗氧化剂对西瓜汁·OH 清除作用贡献极大，可以排除类胡萝卜素在其中发挥主要作用，尽管看来作用能力与颜色有些联系，但色素不是作用的主要原因。

Ngouohci 与 Nkii 述评在动植物组织中抗氧化剂是与水溶性部分或脂溶性部分相结合的，它们在体内的氧化反应中是不可交换的[15] 从 ashi 等曾报道干早胁迫条件下野生型西瓜叶子中大量积累的瓜氨酸〕以及诱导的类型一 2 金属硫蛋白 CLMT2 都是最有效的·OH 清除剂[10,11]，西瓜果实及由之制成的瓜汁中是否存在这两种物质，尤其是·OH 清除能力更为强大的后者，还不清楚，也未见研究报道Ykoota 等[14]也报道，极干旱强光下野生西瓜叶子中积累高浓度的瓜氨酸、谷氨酸和精氨酸、以及大肠杆菌的 AgrE 同系物 D 虹 P 一 1蛋白，后者也是有效的·OH 清除剂本研究通过西。