梳状共聚物对cdca的修饰及对胆固醇结石的溶解作用研究.pdf

华中科技大学 博士学位论文 梳状共聚物对CDCA的修饰及对胆固醇结石的溶解作用研究 姓名：公瑞煜 申请学位级别：博士 专业：材料学 指导教师：乔学亮 20080501 IV 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘摘 要要 胆石症是一种严重危害人类健康的常见病、多发病，其中 80％以上为胆固醇结 石大多数胆固醇结石患者愿意接受保守治疗，其中，口服鹅去氧胆酸（CDCA） 、 熊去氧胆酸（UDCA）有一定疗效，但该法疗程较长、疗效不尽人意，副作用较大 为改善 CDCA 对胆固醇结石的溶解作用，合成水溶性聚羧酸型梳状共聚物和 C60-梳 状共聚物，用该聚合物修饰 CDCA，利用其梳状侧链的熵排斥效应来增强 CDCA 溶 解胆固醇结石的能力，探讨其在磷酸盐缓冲液（PBS 液）和模拟胆汁中，增强 CDCA 溶解胆固醇结石的能力，以及溶解动力学机制 利用高分子设计理论，以烯丙基聚氧乙烯基醚(PAO)、顺丁烯二酸酐(MAn)、C60 和 CDCA 为原料，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，合成具有梳状侧链结构的梳状 共聚物-CDCA 结合物和 C60-梳状共聚物-CDCA 结合物，以 IR 、TLC 和 TEM 法表 征共聚物的结构，并在 pH7.4 的 PBS 液和不同胆固醇饱和指数（CSI）的模拟胆汁中 进行溶石效果的研究，探讨在 PBS 液和不同 CSI 的模拟胆汁中结合物溶解胆固醇结 石的效果和溶解动力学机制。

IR 、TLC 和 TEM 分析结果均表明有梳状共聚物-CDCA 和 C60-梳状共聚物 -CDCA 结合物生成载体 CMP30、CMP20、CMP4、CMO10、CMO7、CMO4 粒径 大小分别为：180、110、120、210、190、190 nm溶石实验表明，在 PBS 液和不同 CSI 的模拟胆汁中，梳状共聚物-CDCA 和 C60-梳状共聚物-CDCA 结合物的溶石能力 均高于 CDCA 对照组对于梳状共聚物-CDCA 系列结合物，在 pH7.4 的 PBS 液中， CDCA、MP40-CDCA、MP30-CDCA、MP20-CDCA、MP10-CDCA、 MP4-CDCA、 MOP10-CDCA、MOP7-CDCA、MOP4-CDCA 在 7d 时的溶石率分别为：32.33％、 62.76%、55.01%、82.53%、48.36%、37.5%、73.86%、58.13%、45.1%CDCA、 MP40-CDCA、MP30-CDCA、MP20-CDCA、MP4-CDCA 的溶解速率分别为：5.33、 9.615、6.868、17.59、5.717×10-5mg.cm-2.s-1。

在 CSI=0.6、CSI＝1.0 和 CSI=1.6 的模 拟胆汁中，CDCA、MP4-CDCA、MP20-CDCA、MOP4-CDCA 和 MOP10-CDCA 在 7d 的溶石率分别为： （1）CSI＝0.6：29.08%、46.63%、74.5%、53.6%、67.5%, （2） CSI＝1.0：12.2%、15.77%、21.7%、16.9%、20.5%， （3）CSI＝1.6：6.69%、8.17%、 21.6%、11.7%、18.3%CDCA、MP20-CDCA、MP4-CDCA 的溶解速率在 CSI＝0.6 V 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 的模拟胆汁中，分别为：5.34、21.0、8.53×10-8mg.cm-2.s-1，CSI＝1.0 时，分别为： 4.63、 7.18、 6.17×10-8mg.cm-2.s-1， CSI＝1.6 时， 分别为： 1.57、 4.13、 3.10×10-8mg.cm-2.s-1 对于 C60-梳状共聚物-CDCA 系列结合物，在 pH7.4 的 PBS 液中，CDCA、 CMP30-CDCA、CMP20-CDCA、CMP4-CDCA、CMO10-CDCA、CMO7-CDCA、 CMO4-CDCA 在 7d 时的溶石率分别为： 10.06%、 24.88%、 51.563%、 15.76%、 35.83%、 27.33% 、 19.31% 。

CDCA 、 CMP4-CDCA 、 CMP10-CDCA 、 CMP20-CDCA 、 CMP30-CDCA、CMP40-CDCA 的溶解速率分别为：2.27、2.51、2.66、3.48、2.92、 3.28×10-5mg.cm-2.s-1 目标产物是 CDCA 和 C60的新的水溶性聚合物合成梳状共聚物-CDCA 结合物 最佳反应条件为：以 AIBN 为引发剂，其用量为占单体总质量的 0.1%～1.0％左右， 共聚温度为 80℃，共聚时间为 4.5h，以甲苯为脱水剂，脱水时间为 3.5h，CDCA 与 梳状共聚物的反应时间以 1.5h 为宜合成 C60-梳状共聚物-CDCA 结合物最佳反应条 件为：以 AIBN 为引发剂，引发剂用量为占单体总质量的 0.1%～1.0％左右，自由基 共聚温度为 80℃， C60的用量为 PAO 总质量的 1％左右为宜， 共聚合的时间为 4～7h， 以甲苯为脱水剂，脱水时间为 3.5h，CDCA 与梳状共聚物的反应时间以 1.5h 为宜 在 PBS 液和模拟胆汁中， 结合物均有良好的溶石效果， 且溶石效果均强于 CDCA (P 92％％） ：生物制品，上海广茂生化制品有限公司。

甲醇、乙酸乙酯重结晶三次，TLC（氯仿：甲醇：水＝65: 28: 4 ， v/v/v）检测除主 斑点外，无其它可见斑点 胆固醇 （CS） ： 生物制品， 北京奥博星生物技术责任公司 用热乙醇(95%， vol/vol ) 重结晶三次，TLC（己烷：乙醚：冰醋酸：＝7:3:0.1， v/v/v）检测除主斑点外，无 其它可见斑点，显示其纯度不小于99％ 梳状共聚物-CDCA：本实验室自行合成 总胆固醇试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司 其他试剂均为分析纯 4.5.2 模拟胆结石的制备模拟胆结石的制备 使用单冲压片机 （上海东方红医疗设备厂） 钢冲直径为3mm， 压力 1.5 T·cm-2 制 备，片厚2±0.2 mm，表面积94.2 ±0.04mm2 4.5.3 溶解动力学实验溶解动力学实验 首先配制200 mmol·dm-3 浓度的溶石液（将各结合物和CDCA 分别溶解于0.1 mol·dm-3磷酸盐缓冲液） ，搅拌，pH 7.4在各瓶中加入50 cm3上述溶液，然后加入模 拟胆结石，恒温37℃每2h温和摇动瓶子10 min不加任何药品的溶液中加入模拟胆 结石，作为空白对照按不同时间点从各瓶中吸取0.10 cm3液体， 用于分析溶液中 胆固醇的浓度； 同时将模拟胆结石取出， 蒸馏水冲洗，60℃真空干燥45min（至恒重） ， 用分析天平称量。

4.5.4 化学分析化学分析 样品溶液的胆固醇浓度以总胆固醇检测试剂盒，按说明书中的方法检测 4.6 溶解动力学原理溶解动力学原理 本研究基于下列物理模型该模型提供了一个动力学数据的半定量的处理方法， - 70 - 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 在体外溶解胆固醇结石的研究中，可判定溶解过程中的速度决定步骤从胆汁盐对 胆固醇结石的溶解的理论模型提示，溶解过程分三步： (a) 溶剂与固体表面接触， (b) 发生界面相互作用， (c) 溶质分子脱离晶体表面，进入溶液通常认为，第一步 是一个快速过程，第二或三步为速度决定步骤溶解过程中，穿越Nernst 扩散层的 界面阻力和扩散阻力可用Berthoud [222]推导的方程处理： )/1/( )()( PDh CCA R CCA J bsbs + − = − = (Eq. 4) 式中J为溶解速率，A为固体的表面积，Cs为饱和溶液中溶质的浓度，Cb为溶 液浓度 (对于静止溶液中的溶解过程，Cb = 0)， R为溶解过程的总阻力，D为溶液 中溶质的扩散系数，h是Nernst扩散层的厚度，P为界面障碍有限渗透系数 当表面相互作用很快时，1/P可忽略不计则由Eq. 4可推得Nernst方程[223]： h CCAD J bs )(− = (Eq. 5) 则溶解过程为扩散控制。

如果表面相互作用很慢，1/P比h/D大，此时： J = AP ( Cs – Cb) (Eq. 6) 则溶解过程为界面障碍控制 4.7 胆固醇结石在梳状共聚物胆固醇结石在梳状共聚物-CDCA 溶液中的溶解动力学溶液中的溶解动力学 胆固醇结石在MPn-CDCA的 PBS溶液中的溶解数据见图4-6和图4-7 由图可 知，胆固醇结石的溶解量和溶解速率是时间的函数，且随时间而增加，达到溶解平 衡后，溶解量和溶解速率达到最大值每个样品均重复3次，实验数据重复性好， 平衡值的标准偏差均在2%～2.5%的范围之内 - 71 - 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 0 1 2 3 4 5 6 0246810 time /h cholesterol, mg/ml MP20-CDCA MP40-CDCA MP30-CDCA MP10-CDCA CDCA 图 4-图 4-6 胆固醇的浓度与时间的关系（胆固醇的浓度与时间的关系（37℃）℃） Fig. 4-4-6 Relation of concentration of cholesterol and time at 37 ℃℃ 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0246810 time /d cholesterol, mg/ml MP20-CDCA MP40-CDCA MP30-CDCA MP10-CDCA CDCA 图 4-图 4-7 胆固醇结石的溶解平衡（胆固醇结石的溶解平衡（37℃）℃） Fig. 4-4-7 Equilibrium solubility of cholesterol gallstone at 37℃℃ 由图4-6和图4-7计算可得溶解度Cs、单位面积的溶解速率J/A（以下简称溶解 速率） 、总阻力R和界面阻力1/P(P是界面障碍的有效渗透系数)，结果列于表4-5。

表中所列的Cs和J/A值均为至少2次以上重复实验的平均值R值根据 Eq.4 计算 而得， 本研究为静态溶解法， 根据静态溶解的假设Cb=0 表中所列的R值由Cs 和 J/A 的平均值计算而得 - 72 - 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 表 4-表 4-5 胆固醇结石的溶解实验：在含胆固醇结石的溶解实验：在含 0.2 mol·L －－1 MPn-CDCA 的 的 0.1 mol·L －－1 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中，溶解度）中，溶解度(Cs)，溶解速率，溶解速率(J/A)，总阻力，总阻力(R)和和 1/P 的数据的数据 Table 4-4-5 Cholesterol dissolving experiments: solubility (Cs)，， dissolution rate (J/A), total resistance (R), and 1/P in 0.2 mol/L MPn-CDCA containing 0.1 mol/L phosphate buffer at pH 7.4 Compounds Csa (J/A)b×105 Rc×10-4 (1/P)c×10-4 CDCA 0.2431 5.33 0.4562 2.2622 MP10-CDCA 3.095 5.717 5.423 5.193 MP20-CDCA 12.972 17.59 7.375 7.145 MP30-CDCA 5.248 6.868 7.641 7.411 MP40-CDCA 5.790 9.615 6.021 5.791 a In mg.cm-3；b In mg.cm-2.s-1；c In sec.cm-1 由图4-6、图。