蛋白酶的筛选.docx

蛋白酶的筛选1、 取土壤，晾干，过40目筛，用无菌水梯度稀释至O.OOOOOIg 土/1mL水或 O.OOOOOOIg 土/lmL 水，待用2、 配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板；配LB培养基或发酵培 养基，灭菌，分作液体培养基，另外取一些倒斜面3、 取1的融入土壤的水1mL涂平板，置于恒温箱，于50度或以上培养 1〜3天，挑选有水解圈（透明圈）的菌落用来划斜面（LB）,于50度或 以上进行纯化培养4、 取纯化菌株，于液体LB中扩大培养5、 离心，取沉淀，盐析，透析，得酶液6、 以酪蛋白为底物，测酶液酶活，若酶活较大，则该菌株为你要的菌株 了初筛1：用选择性培养基，把PH调低，则耐酸的才能活，另外，把N源去掉， 加入酪素（酪蛋白），其他营养成分照基础培养基就行了，这样，产蛋白酶的菌 种能将酪素分解成酪氨酸，就有可利用的 N 源，不产蛋白酶的菌种不能利用酪 素，则没有 N 源，最后耐酸又产蛋白酶的菌种成为优势菌，挑出，换培养基初筛 2：初筛 1 所得菌种用透明圈法（蛋白酶水解酪素产生透明圈，直径越大，酶活越高，具体步骤自己找）挑出蛋白酶活力高的菌种，接入摇瓶培养 复筛：初筛2所得菌以福林试剂法测酶活（以Folin染色，测吸光度，具体步骤 自己找），酶活最高者为最终菌种。

酪素培养基成分：酪蛋白牛肉膏磷酸氢二钠氯化钠琼脂蒸馏水0.4%溴麝香草酚蓝溶液10g3g2g5g15g 1000mL 12.5mLpH7.4制法：将除指示剂外的各成分混合，加热溶解（但酪蛋白不溶解），校正pH加 入指示剂，分装烧瓶，121°C高压灭菌15min临用时加热溶化琼脂，冷至50°C， 倾注平板注：将菌株划线接种于平板上，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白干酪素培养基（用于蛋白酶菌株筛选）分别配制A液和B液A液：称取Na2HPO4・7H2O 1.07g干酪素4g,加适量蒸馏水，并加热溶解B液：称取KH2PO4 0.36g，加水溶解A、B液混合后，加入酪素水解液0.3 mL,加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至 1000mL酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽抱杆菌蛋白 酶25mL加水至100mL, 30°C水解山用于配制培养基时，其用量为1000mL培 养基中加入100mL以上水解液三、酪蛋白培养基KH2PO4 0．36gNa2HPO4 ・12H2 O 1. 3gNaCl 0．1gZnSO4 ・7H2 O 0. 02gCaCl2 ・2H2 O 0. 002g酪素 4g酪素水解氨基酸 0．05g琼脂 15—20g蒸馏水 1000mlpH 7．0—7．2先称取4g酪素，再加入0. 5mol/LNaOH约2ml，将酪素溶解；然后依次加 入其他药品，最后调pH7. 0一7. 2。

0. 56kg/cm2 （8磅/英寸2 ）， 112. 6°C灭 菌 30 分钟。