比色法和分光光度法课件.ppt

一一. 概述概述 (1) 比色法和可见分光光度法的特点比色法和可见分光光度法的特点 比色法比色法: 在分析化学中在分析化学中, 利用比较利用比较 有色溶液颜色的深浅来测定物质含有色溶液颜色的深浅来测定物质含 量的分析方法称为比色法过去大量的分析方法称为比色法过去大 多用眼睛观察比较多用眼睛观察比较, 故又称目视比故又称目视比 色法 第二节第二节 比色法和可见分光光度法比色法和可见分光光度法比色法和分光光度法光电比色法光电比色法(分光光度法分光光度法): 随着近代分析仪器的发展随着近代分析仪器的发展, 目前已目前已 普遍使用光电比色计普遍使用光电比色计(分光光度计分光光度计)通通 过测量有色溶液对入色光的吸收程度过测量有色溶液对入色光的吸收程度 对物质进行分析对物质进行分析, 称为光电比色法称为光电比色法(分分 光光度法光光度法)比色法和分光光度法与目视比色法相比与目视比色法相比, 光度法的特点光度法的特点: ①① 灵敏度高灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ②② 准确度较高准确度较高; ③③ 仪器设备较简单仪器设备较简单, 操作简便、操作简便、 快速；快速； ④④ 应用广泛。

应用广泛比色法和分光光度法(2) 光的性质和物质的颜色光的性质和物质的颜色 光的性质光的性质: 光是一种电磁波光是一种电磁波, 具具 有波粒二象性光的波动性可用有波粒二象性光的波动性可用波长来描述波长来描述, 其单位常用纳米其单位常用纳米(nm)表示表示, 波长越短波长越短, 能量越高能量越高比色法和分光光度法 具有同一波长的光称为单色光具有同一波长的光称为单色光,由不由不同波长光组成的光称为复合光同波长光组成的光称为复合光比色法和分光光度法 互补色光互补色光: 若将两种颜色的光按适当的若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光强度比混合可成白光, 那么这两种光称为那么这两种光称为互补色光互补色光比色法和分光光度法物质的颜色物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的物质对光的吸收是具有选择性的 当一束白光通过溶液时当一束白光通过溶液时, 若溶液对各若溶液对各 种色光都不吸收种色光都不吸收, 则白光全部通过则白光全部通过, 溶液呈无色透明溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全若各种色光几乎全 被吸收被吸收, 则溶液呈黑色则溶液呈黑色; 若溶液只吸收若溶液只吸收 某种色光某种色光, 则溶液呈透过光的颜色则溶液呈透过光的颜色, 也也 就是说就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。

颜色比色法和分光光度法 例如例如, 白光通过白光通过CuSO4溶液时溶液时, 溶溶液液 颜色为蓝色颜色为蓝色比色法和分光光度法 吸收曲线吸收曲线: 为了精确表明溶液对不为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况同波长光的吸收情况, 可将不同波长可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸测量该溶液对各单色光的吸 收程度收程度, 即吸光度即吸光度, 以波长为横坐标以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为即为 吸收曲线吸收曲线, 或称吸收光谱或称吸收光谱比色法和分光光度法比色法和分光光度法二、朗伯二、朗伯-比尔定律比尔定律 (1) 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律 透光度透光度(透光率透光率T):吸光度吸光度(A):朗伯朗伯-比尔定律比尔定律:比色法和分光光度法 此式表明此式表明: 当一束平行的单色光通当一束平行的单色光通 过吸光物质的均匀溶液时过吸光物质的均匀溶液时, 溶液的吸溶液的吸 光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成 正比。

正比 K:比例常数比例常数, 与入射光波长与入射光波长, 溶液溶液 中吸光物质的本性及溶液的温度有中吸光物质的本性及溶液的温度有 关比色法和分光光度法(2) 吸光系数吸光系数 当当b以以cm, c以以g/L为单位为单位, K为吸光为吸光 系数系数, 用符号用符号a表示表示, 单位为单位为L/g · cm A=abc 当当b以以cm, c以以mol/L为单位时为单位时, K为为 摩尔吸光系数摩尔吸光系数, 用符号用符号ε表示表示, 单位单位 为为L/ mol · cm A=εbc a与与ε的关系的关系: 比色法和分光光度法 比吸光系数比吸光系数( ): 指质量浓度指质量浓度为为 1%(g/mL), b为为1cm时的吸光度时的吸光度值值, 单位为单位为mL/g · cm 同一物质的同一物质的ε与与 之间的关系之间的关系:比色法和分光光度法 例例1 一含一含Fe2+浓度为浓度为0.5mg/L的溶的溶 液液, 用邻二氮菲显色测定用邻二氮菲显色测定, 吸收池厚吸收池厚 度为度为2cm,在在508nm处测得吸光度为处测得吸光度为 0.19, 求其摩尔吸光系数和比吸光系求其摩尔吸光系数和比吸光系 数。

数比色法和分光光度法比色法和分光光度法(3) 偏离朗伯偏离朗伯-比尔定律的原因比尔定律的原因 标准曲线标准曲线: 根据朗伯根据朗伯-比尔定律比尔定律,当当 吸收池厚度不变吸收池厚度不变, 以吸光度为纵坐以吸光度为纵坐 标标, 浓度为横坐标作图时浓度为横坐标作图时, 应得到一应得到一 条通过原点的直线条通过原点的直线, 称为校正曲线或称为校正曲线或 标准曲线标准曲线比色法和分光光度法偏离朗伯偏离朗伯-比尔定律的主要原因比尔定律的主要原因: ①① 定律仅适用于稀溶液定律仅适用于稀溶液 ②② 化学变化引起的偏离化学变化引起的偏离(正偏离正偏离) ③③ 非单色入射光引起的偏离非单色入射光引起的偏离(负负 偏离偏离)比色法和分光光度法比色法和分光光度法三三. 方法和仪器方法和仪器 (1) 目视比色法目视比色法 目视比色法目视比色法: 用眼睛观察比较溶液颜色深用眼睛观察比较溶液颜色深度以测量物质含量的分析方法称度以测量物质含量的分析方法称为目视比色法为目视比色法比色法和分光光度法标准系列法的原理标准系列法的原理: 朗伯朗伯-比尔定律对标准系列法原比尔定律对标准系列法原理的解释理的解释: A=εsbscs=εxbxcx比色法和分光光度法标准系列法的优点标准系列法的优点: ①① 仪器简单仪器简单, 操作简便操作简便,适宜于大适宜于大批批 试样分析试样分析 ②② 适宜于稀溶液中微量组分的测定适宜于稀溶液中微量组分的测定 ③③ 某些不完全符合朗伯某些不完全符合朗伯-比尔定律比尔定律 的显色反应的显色反应, 仍可用此法进行测仍可用此法进行测 定。

定标准系列法的缺点标准系列法的缺点: 准确度较差准确度较差比色法和分光光度法(2) 光电比色法和可见分光光度法光电比色法和可见分光光度法 ①① 光电比色法的原理光电比色法的原理: 所用仪器为所用仪器为光电比色计光电比色计 光源光源→滤光片滤光片→一定波长范围的一定波长范围的近似单色光近似单色光→有色溶液有色溶液→透过光透过光→光电池光电池→检流计的标盘检流计的标盘比色法和分光光度法 可见分光光度法所用的仪器称为可见分光光度法所用的仪器称为 分光光度计分光光度计, 它是利用分光能力很强的它是利用分光能力很强的棱镜或光栅的原理棱镜或光栅的原理, 作为单色器作为单色器, 可连可连续获得不同波长的单色光续获得不同波长的单色光, 其波长范围其波长范围比用滤光片获得的更窄因此用分光比用滤光片获得的更窄因此用分光光度计可连续测量某一定浓度有色溶光度计可连续测量某一定浓度有色溶液在不同波长下的吸光度液在不同波长下的吸光度, 从而可得其从而可得其吸收光谱吸收光谱,通过吸收光谱可选择最适宜通过吸收光谱可选择最适宜的测定波长的测定波长比色法和分光光度法 所以分光光度计采用适当的光源所以分光光度计采用适当的光源 和检测器和检测器, 使测量的范围不只局限于使测量的范围不只局限于 可见光区。

如用红外光作为光源成可见光区如用红外光作为光源成 为红外分光光度法为红外分光光度法; 用紫外线作为光用紫外线作为光 源称为紫外分光光度法源称为紫外分光光度法比色法和分光光度法②② 光电比色计和可见分光光度计的光电比色计和可见分光光度计的 基本部件基本部件光光 源源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器指示器指示器比色法和分光光度法a. 光源光源 要求要求: 光源须具有足够的辐射强度光源须具有足够的辐射强度, 且稳定性好且稳定性好 钨灯是可见分光光度计常用钨灯是可见分光光度计常用 的光源比色法和分光光度法b. 单色器单色器 光电比色计光电比色计: 用滤光片获得单色光用滤光片获得单色光 选择滤光片的原则是选择滤光片的原则是: 滤光片最易滤光片最易 透过的光应是有色物质最易吸收的透过的光应是有色物质最易吸收的 光光, 即滤光片的颜色与溶液的颜色应即滤光片的颜色与溶液的颜色应 为互补色为互补色; 也可以使用不同的滤光片也可以使用不同的滤光片 测量同一有色溶液的吸光度测量同一有色溶液的吸光度, 测得吸测得吸 光度最大时所用的滤光片就是最适光度最大时所用的滤光片就是最适 宜的滤光片。

宜的滤光片比色法和分光光度法 分光光度计分光光度计: 单色器由棱镜或光栅、单色器由棱镜或光栅、狭缝和准直镜等部分组成狭缝和准直镜等部分组成 棱镜棱镜: 色散元件色散元件, 有石英或玻璃两有石英或玻璃两种种, 它们对不同波长光具有不同的折它们对不同波长光具有不同的折射率石英棱镜对紫外光分光效果好射率石英棱镜对紫外光分光效果好, 玻璃棱镜对可见光分光效果好玻璃棱镜对可见光分光效果好, 因为因为玻璃对紫外光有吸收玻璃对紫外光有吸收, 故不能用于紫故不能用于紫外光区比色法和分光光度法比色法和分光光度法 光栅光栅:色散元件色散元件, 利用光的衍射和干利用光的衍射和干 涉原理制成当白光通过密刻平行条涉原理制成当白光通过密刻平行条 痕的光栅后痕的光栅后, 将不同波长的光色散成将不同波长的光色散成 连续光谱具有波长范围宽、色散均连续光谱具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点匀、分辨本领高等优点比色法和分光光度法c. 吸收池吸收池(比色皿比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液用于盛装被测试液和参比溶液 按制作材料不同分为石英吸收按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。

池和玻璃吸收池比色法和分光光度法d. 检测器检测器 作用作用: 是将光强度信号转换为可是将光强度信号转换为可 测电信号测电信号, 常见检测器有光电池和常见检测器有光电池和 光电管 光电池光电池: 国产国产581-G型光电比色型光电比色 计及计及72型分光光度计型分光光度计比色法和分光光度法比色法和分光光度法优点优点: 光电池灵敏度较高光电池灵敏度较高, 产生的光电产生的光电 池不需要经过放大便可直接用池不需要经过放大便可直接用 灵敏检流计测量灵敏检流计测量缺点缺点: 光电池经强光照射或连续使用时光电池经强光照射或连续使用时 间过长间过长, 易产生易产生“疲劳现象疲劳现象”, 导导致致 灵敏度降低灵敏度降低, 遇此情况遇此情况, 应暂停使应暂停使 用并避光放置用并避光放置, 待其复原后再用待其复原后再用比色法和分光光度法光电管光电管: 国产国产721型分光光度计型分光光度计比色法和分光光度法e. 指示器指示器比色法和分光光度法(3) 常用光电比色计和分光光度计常用光电比色计和分光光度计 光电比色计光电比色计: 国产国产581-G型型, 仪器仪器通通 常配有红色、绿色、蓝色三块滤光常配有红色、绿色、蓝色三块滤光 片片, 其透过光的最大波长分别在其透过光的最大波长分别在650、、 530和和440mm左右。

左右比色法和分光光度法可见光光度计可见光光度计: 国产国产721型分光光度计型分光光度计比色法和分光光度法四、显色反应及其影响因素四、显色反应及其影响因素 显色反应显色反应: 将被测组分转变为有色将被测组分转变为有色 化合物的反应称为显色反应化合物的反应称为显色反应 显色剂显色剂:使被测组分显色的试剂称使被测组分显色的试剂称 为显色剂为显色剂比色法和分光光度法(1) 对显色反应的要求对显色反应的要求 ①① 选择性好选择性好 ②② 灵敏度高灵敏度高 ③③ 有色化合物组成恒定有色化合物组成恒定 ④④ 有色化合物的化学性质稳定有色化合物的化学性质稳定 ⑤⑤ 显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收比色法和分光光度法(2) 显色剂显色剂 显色剂可分为无机显色剂和有机显显色剂可分为无机显色剂和有机显 色剂两大类由于大多数有机显色色剂两大类由于大多数有机显色 剂能与金属离子形成稳定的有特征剂能与金属离子形成稳定的有特征 颜色的螯合物颜色的螯合物, 灵敏度较高灵敏度较高, 选择性选择性 也较好。

因此也较好因此, 在比色分析和光度分在比色分析和光度分 析中主要选用有机显色剂析中主要选用有机显色剂比色法和分光光度法两种常用的有机显色剂：两种常用的有机显色剂： ①① 邻二氮菲邻二氮菲 其结构式为其结构式为 这是目前广泛用于测定这是目前广泛用于测定Fe2+的较好的的较好的显色剂先用盐酸羟胺把待测试液显色剂先用盐酸羟胺把待测试液中的中的Fe3+还原为还原为Fe2+ ,然后在然后在pH5~6的条件下的条件下,与邻二氮菲反应与邻二氮菲反应,生成稳生成稳定的橙红色配合物，配合物的定的橙红色配合物，配合物的λmax为为508nm.反应是特效的反应是特效的,灵敏度也较高，灵敏度也较高，摩尔吸光系数摩尔吸光系数ε为为1.1×104L/mol.cm比色法和分光光度法②②. 双硫腙双硫腙 其结构式为其结构式为比色法和分光光度法(3) 影响显色反应的因素：影响显色反应的因素： ①① 显色剂的用量：显色剂的用量： 显色反应表示式显色反应表示式: M+R MR (被测组分被测组分)(显色剂显色剂)(有色配合物有色配合物) 显色剂的用量应当适宜显色剂的用量应当适宜,其用量是其用量是 通过实验确定。

通过实验确定比色法和分光光度法比色法和分光光度法实验方法为：固定被测组分的浓度和实验方法为：固定被测组分的浓度和其它条件其它条件,改变显色剂在溶液中的浓度改变显色剂在溶液中的浓度cR,分别测量吸光度分别测量吸光度(A),绘制绘制A-cR曲线比色法和分光光度法比色法和分光光度法②② 溶液的酸度溶液的酸度 适宜酸度范围确定方法：适宜酸度范围确定方法： 固定显色剂和被测组分的浓度固定显色剂和被测组分的浓度, 改变溶液的改变溶液的pH值值,分别测量吸光度分别测量吸光度, 绘制绘制A- pH曲线曲线平坦部分所曲线曲线平坦部分所 对应的对应的pH值即为适宜的酸度范围值即为适宜的酸度范围比色法和分光光度法③③ 显色时间显色时间 作吸光度作吸光度-时间曲线时间曲线, 确定适宜确定适宜的的 显色时间显色时间 ④④ 显色温度显色温度 ⑤⑤ 溶剂的性质溶剂的性质⑥⑥ 共存离子的干扰及其消除共存离子的干扰及其消除比色法和分光光度法 消除共存离子干扰的方法：消除共存离子干扰的方法： a.控制溶液的酸度控制溶液的酸度 b. 加入掩蔽剂加入掩蔽剂 c. 分离干扰离子分离干扰离子比色法和分光光度法五、光度测量条件的选择五、光度测量条件的选择 (1) 选择合适波长的入射光选择合适波长的入射光 ①① 选被测有色物质的选被测有色物质的λmax为入射为入射 光光 ②② 如在如在λmax处显色剂或干扰组分处显色剂或干扰组分 有明显的吸收有明显的吸收, 则应选灵敏度较则应选灵敏度较 低但能避免干扰的适宜波长的光低但能避免干扰的适宜波长的光 作为入射光。

作为入射光比色法和分光光度法(2) 选择适宜的参比溶液选择适宜的参比溶液 ①①. 当被测溶液、显色剂及所用其他当被测溶液、显色剂及所用其他试剂均无色试剂均无色,可用纯溶剂作为参比溶可用纯溶剂作为参比溶液液, 称为溶剂空白称为溶剂空白 ②②. 当显色剂无色而被测试液中存在当显色剂无色而被测试液中存在其他有色离子时其他有色离子时,可用不加显色剂的可用不加显色剂的被测试液作为参比溶液被测试液作为参比溶液,称为试样空称为试样空白 ③③. 当显色剂或其他试剂有色当显色剂或其他试剂有色,可用显可用显色剂或其他试剂作为参比溶液色剂或其他试剂作为参比溶液,称为称为试剂空白试剂空白比色法和分光光度法④④. 用不含被测组分的试样用不含被测组分的试样, 在相同条件在相同条件 下与被测试样同时进行处理下与被测试样同时进行处理, 测吸光测吸光 度时以前者所得溶液为参比溶液度时以前者所得溶液为参比溶液, 称称 为平行操作空白如临床上进行某为平行操作空白如临床上进行某 种药物浓度的监测种药物浓度的监测,取正常人血样和取正常人血样和 待测血药浓度的血样在相同条件下待测血药浓度的血样在相同条件下 处理处理, 用前者得到的溶液作为参比溶用前者得到的溶液作为参比溶 液。

液比色法和分光光度法(3) 控制适当的吸光度读数范围控制适当的吸光度读数范围 适宜读数范围适宜读数范围: 吸光度吸光度A在在0.15~1.0内，内， 或透光度或透光度T值在值在0.10~0.70内 六六.比色法和可见分光光度法的定量方比色法和可见分光光度法的定量方法法 (1) 校正曲线法校正曲线法(适用于经常性的批量分适用于经常性的批量分 析）析） (2) 标准对比法（标准品对照法）标准对比法（标准品对照法） 此法适宜于非经常性的分析工作此法适宜于非经常性的分析工作比色法和分光光度法 当校正曲线通过零点时当校正曲线通过零点时,将样品溶将样品溶液和一标准溶液在选定实验条件下液和一标准溶液在选定实验条件下显色显色,测得吸光度分别为测得吸光度分别为Ax和和As,标标准溶液的浓度为准溶液的浓度为cs,则样品溶液的浓则样品溶液的浓度度cx可按下式求得：可按下式求得：比色法和分光光度法 在药物分析中在药物分析中, 为了测定方便为了测定方便, 通通常常 使被测试样称样量和稀释倍数与标准使被测试样称样量和稀释倍数与标准 试样一致试样一致,则被测试样的含量则被测试样的含量ω可由测可由测 量的两者吸光度的比求得量的两者吸光度的比求得,即即比色法和分光光度法 另外另外,在药物分析中在药物分析中,还常用与标准还常用与标准 品的比吸光系数比较进行含量测定。

品的比吸光系数比较进行含量测定 如被测试样称样量和稀释倍数与标准如被测试样称样量和稀释倍数与标准 品一致品一致,在相同条件下在相同条件下,测得被测试样测得被测试样 与标准品的比吸光系数分别为与标准品的比吸光系数分别为 和和 则试样质量浓度则试样质量浓度 为为比色法和分光光度法七七. 比色法和可见分光光度法在医学检比色法和可见分光光度法在医学检 验中的应用验中的应用 全血中铁的测定全血中铁的测定 全血中铁的测定需要先将各种形式全血中铁的测定需要先将各种形式的铁转化为游离的的铁转化为游离的Fe3+离子通常用离子通常用消化法消化法,蛋白质用钨酸沉淀除去蛋白质用钨酸沉淀除去,取无取无 蛋白的滤液蛋白的滤液,在一定条件下加在一定条件下加KSCN显显色剂色剂,生成血红色配合物生成血红色配合物,反应式为反应式为比色法和分光光度法 在在520nm波长处或用蓝绿色滤光片波长处或用蓝绿色滤光片 测量吸光度测量吸光度,与标准溶液比较与标准溶液比较,求出求出含含 量比色法和分光光度法。