细胞生物学实验指导目录.docx

细胞生物学实验指导、乙刖 百本实验指导是在龚宁所编《细胞生物学实验指导》（ 2003年2月）的基础上修订而成，此次修订是根据实验内容的变化进行的，删除了已经纳入《生物技术大实验》的内 容，增设了微分干涉差显微镜的使用、电子显微镜演示、细胞凋亡等内容本实验指导编写过程中参考了杨汉民主编 《细胞生物学实验》（1997年7月第二版）、 李素文主编《细胞生物学实验指导》 （2001年10月第一版）和中国农业大学生物学院所编《细胞生物学实验指导》（2000年4月），设置了 15个实验，使用时可根据当时的具 体情况选作10个由于编者的水平有限，本指导中难免错漏之处，恳请使用本指导的师生提出批评和 建议，以便及时修改编者2007年1月3日龚宁宋庆发张玉霞编细胞生物学实验指导目录实验一 细胞形态结构的观察及大小测定 1实验二 微分干涉差显微镜的使用 2实验三 口腔上皮细胞的荧光观察 4实验四 叶绿体的提取 5实验五 植物材料中DNA勺提取 6实验六 细胞膜的渗透性 8实验七 光镜下植物细胞骨架的制片技术及观察 10实验八 线粒体和液泡系的超活染色与观察 11实验九 DNA的细胞化学反应——Feulgen反应 13实验十 RNA的细胞化学反应——Unna反应 15实验十一 小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察 17实验十二 联会复合体的染色与观察 18实验十三去壁低渗法制备植物染色体标本 19实验十四细胞凋亡 22实验十五 透射及扫描电镜演示实验 23实验一细胞形态结构的观察及大小测定一、实验目的：1、观察几种细胞的形态结构2、掌屋用测微尺测定细胞大小的原理和方法二、实验原理：测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两者配合 使用，可以测量细胞大小。

目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃园片， 园片中央刻有一条直线，此线分为若干格物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长 1mm被等分为100格，长为 0.01mm（10N m）当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺因目 微尺测量的细胞是经物镜放大后的像， 而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变， 在测 量时需要先用物微尺来标定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度， 然后再用以测 定细胞大小将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点 线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数）， 按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：物微尺格数目微尺每格所代表的实际长度=- X 10 ^m目微尺格数例如：目微尺是100格，其对应白^物微尺是80格，则目微尺每格所代表的实际长度为 80/100 X 10=8 仙 mi测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5格，则此细胞横径为8X5=40仙mi三、实验用品：普通光学显微镜 载玻片 盖玻片银子消毒牙签烧杯吸管0.9%生理盐水蒸储水 吸水纸四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞；洋葱内表皮；的产碎叶片；保存于阿氏液中的鸡血；甜椒五、方法步骤：（一）、细胞形态结构的观察：1、人口腔上皮细胞的观察：1）、在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水。

2）、用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下3）、把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂抹几下4）、用银子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻 地盖在水滴上5 ）、用显微镜观察细胞形状，细胞呈扁平鳞状2、取洋葱内表皮，同上法制作临时装片（将生理盐水换成蒸储水），用显微镜观察，可见长条状的洋葱内表皮细胞3、取的产碎叶片，制作临时装片（制作方法同洋葱内表皮），用显微镜观察，可见内含许多叶 绿体的叶细胞，细胞呈什么形状？4、制作鸡血涂片，用显微镜观察红细胞5、取甜椒一片，用刀片刮去果肉，将表皮制成临时装片，用显微镜观察表皮细胞，能看见胞 间连丝吗？（二）、细胞大小的测定：1、将目微尺放于目镜内2、将物微尺放在显微镜的载物台上3、小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重 合处4、记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺 每格所代表的实际长度：物微尺格数目微尺每格所代表的实际长度=- X 10 ^m目微尺格数5、将制作的各种细胞临时装片置于载物台上，测定细胞的大小（包括长径和短径）。

六、注意事项：1、制作临时装片时避免产生气泡2、用物微尺标定的目微尺每格长度的数值代表在某一放大系统下的情况，这一数值会随物镜 的放大率而改变，因此，在什么放大倍数物镜下标定的目微尺只能在同一放大倍数的物镜下测 定细胞的大小七、作业：1、绘出你所观察到的洋葱表皮细胞和萌产碎叶细胞图， 指出各部分的名称2、列表说明你所测出的几种细胞的大小实验二 微分干涉差显微镜的使用一- 用微分干涉差显微镜观察口腔上皮细胞一、实验目的：1 .了解微分干涉差显微镜观察活细胞的原理2 . 了解微分干涉差显微镜的特殊组件和位置3 .掌握微分干涉差显微镜的基本操作步骤二、实验原理：微分干涉差显微镜是根据通过物体内只分开 1um或者更短距离的2束相干的光之间的相位差设计的，使标本内邻近 2点的光程差被显微镜中特殊的光学系统转变为振幅（光强度） 的变化从而可以观察到标本内细微的结构，所以称为微分干涉差显微镜根据照明方式， 微分干涉差显微镜分为落射式和透视式 2种，生物学和医学观察中多采用透射式微分干涉差 显微镜微分干涉差显微镜包含 2块正交的偏光镜：一块靠近光源，称为起偏镜：另一块靠近目 镜，称为检偏镜在起偏镜和聚光镜之间放置第一块渥氏棱镜，在物镜和检偏镜之间放置第 二块渥氏棱镜，这就是微分干涉差显微镜的基本结构。

其基本原理是：来自光源的自然光经 过起偏镜后成为线偏振光，以 45度方位角（入射光偏振方向与晶体光轴之间的夹角）垂直 入射到第一块渥氏棱镜，这时入射偏光分解为振动方向互相垂直、传播方向一致的 光和E光，穿过第一块渥氏棱镜的中心点后，由于晶体光轴方向的改变， 光和E光从中心点散发开一个很小的角度，经过聚光镜后产生出间隔只有 1um甚至更短些的平行光，穿过样品的 2个点由于光线通过标本的 2个点的光程长度不同，2束光线的相位都发生了变化，带有标 本2个邻近点的相位差信息的这 2束线偏振光通过物镜后，会聚在第2块渥氏棱镜的中心点， 组合在一起的这2束线偏振光相位差不同，偏振方向互相垂直，不能直接干涉成像当它们 通过检偏镜后成为振动面相同、频率相同且具有一定相位差的相干光束，因而在中间像平面 上形成干涉的物像三、实验用品微分干涉差显微镜 载玻片 盖玻片银子消毒牙签烧杯吸管0.9%生理盐水 吸水纸四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞五、方法步骤：(一)、制作人的口腔上皮细胞的临时装片1 .在洁净的载玻片中央，滴一滴生理盐水2 .用消毒牙签的一端，在漱净的口腔侧壁上轻轻地刮几下3 .把牙签上附有碎屑的一端，放在载玻片上的生理盐水滴中涂抹几下。

4 .用银子夹起洁净的盖玻片，将它的一边先接触载玻片上的生理盐水滴，然后，轻轻地 盖在水滴上二)、用微分干涉差显微镜观察人的口腔上皮细胞1 .将10 X微分干涉差物镜旋入光路，并调入相应的渥氏棱镜即 N调焦距和起偏镜使其与检偏镜正交，产生最好的图像，并观察细胞的结构2 .将40X微分干涉差物镜旋入光路，并调入相应的渥氏棱镜即 N 20调焦距和起偏镜使其与检偏镜正交，产生最好的图像，并观察细胞结构六、注意事项：1 .选取的载玻片的厚度在1m法右，不要太厚；要清洗干净2 .样品制备时，防止产生气泡七、作业：1.根据所观察到的细胞，画一个口腔上皮细胞图，并且注出各部分的名称 ^实验三、口腔上皮细胞的荧光观察一、实验目的:1、初步了解荧光显微镜的基本组件、位置和基本光路2、初步掌握荧光显微镜的基本调节步骤3、通过在荧光显微镜下观察口腔上皮细胞的细胞核和线粒体，了解荧光探针与细胞成分的结 合特性和光谱特性二、实验原理:本实验用的 2种活细胞荧光探针分别为 Hoechst 33342 ( Ho.33342)和罗丹明123(Rho-damine 123)Hoechst 33342 (Ho.33342)是双苯并咪唾类的一种衍生物，是一种亲脂性物质，能跨膜进 入活细胞，在低浓度下毒性较弱.是一种能与DN端异性结合白^荧光探针，该探针的特点是既能 与死细胞又能与活细胞的 DN端异性结合，因此被大量地应用于活细胞观察与定量的科学研究 工作中。

它的激发光波长约 350nmi发射光波长约461nm罗丹明123是一种亲脂性阳离子荧光探针， 也能穿过活细胞的膜实验证实，罗丹明123 被线粒体吸收与电性吸引有关线粒体内膜本身因富含负电性的糖蛋白而带负电荷，内膜外 有大量质子积累造成外正内负的跨膜电位差而罗丹明 123具有正电荷，由于电性相吸，特异地标记上线粒体它的激发光波长约 507nm3发射光波长约为529nmi可用蓝光激发，被标记的线粒体发出绿色荧光三、实验用品：1、药品：含 5-10ug/ml Ho.33342 的 PBS(pH7・ 4);含 10ug/ml 罗丹明 123 的 PBS(pH7・ 4)2、仪器和用具：荧光显微镜、温箱、载玻片、盖玻片、牙签、滤纸条、银子、滴管等四、实验材料：口腔黏膜上皮细胞五、方法步骤：1、用牙签刮取口腔上皮黏膜细胞，分别涂于 2张载玻片上2、在2张载玻片的涂细胞处分别滴加 Ho33342染液和罗丹明染液各一滴，在 37c暗处孵育 20-30min3、加盖玻片(注意防止气泡)，用滤纸条吸掉盖玻片周围多余的水分4、荧光观察细胞核：先关闭激发光，将滴加 Ho33342染液的装片至于透射光下，找到样品焦面，再关闭透射光，置于激发光为紫外光(UM、发射兰色荧光的滤片组合块下观察细胞核。

先用10X荧光物镜观察，再换用40X荧光物镜观察5、荧光观察线粒体：先关闭紫外激发光，将滴加罗丹明 123的载玻片置于透射光下，找到样品焦面，再关闭透射光，置于激发光为兰光、发射绿色荧光的滤片组合块下观察线粒体先用10X荧光物镜观察，再换用40X荧光物镜观察六、注意事项：1 .盖片时防止产生气泡2 .滴加的染料不宜太多，否则背景太深，影响观察3 .注意避光，包括制片、荧光观察和探针保存4 .荧光探针都有一定的毒性，操作时防止污染皮肤和环境七、作业：根据观察实验结果，填表细胞核线粒体灭光探针激发光发射光形态（画出）实验四、叶绿体的提取一、实验目的:通过本实验掌握分离叶绿体的技术，并了解制备细胞器的一般程序二、实验原理：细胞器的分离一般采用差速离心法，细胞经过破碎后，在适当的介质中进行差速离心, 利用细胞各组分质量大小不同，在不同离心力的作用下，即可得到所需的组分三、实验用品:1、介质的配制：A:配制0.5M的蔗糖水溶液B:磷酸钾缓冲液：将KHPO（分析纯）溶于A液中，使其浓度为0.1M,PH调至7.4C:完全介质：将EDTA-N2溶于B液中,使其浓度为10mM,PHM至7.42、低速大容量离心机3、研钵一付4、尼龙织物或纱。