高敏pcr检测在乙肝诊疗中应用及价值.pdf

中南大学湘雅二医院中南大学湘雅二医院 陈陈 军军高敏高敏PCR检测技术在乙肝诊疗检测技术在乙肝诊疗中的应用及价值中的应用及价值•我国乙肝的流行现状•高敏PCR监测在慢乙肝治疗中的应用价值及现状•新型国产高敏PCR检测技术的性能评价主要内容Wang FS, Fan JG, Zhang Z, Gao B, Wang HY. The global burden of liver disease: the major impact of China. Hepatology, 2014 ,60(6):2099-108目前，我国肝病的主要病因目前，我国肝病的主要病因1/4 9300万万 慢性慢性HBV感染者感染者1/3 2千万千万~3千万千万 慢性乙肝患者慢性乙肝患者~30万万 肝癌患者肝癌患者全国全国13亿人口，亿人口，5-6亿曾感染亿曾感染HBV, 占全国总人口近占全国总人口近40%1~59岁人群血清岁人群血清HBsAg流行率流行率 7.18%(2006) 1.FM Lu, et al. J. of Viral Hepatitis 2009 2.FM Lu 50:661-662 Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):100-1-7慢乙肝感染的自然史慢乙肝感染的自然史全球权威指南一致认为：乙肝治疗的根全球权威指南一致认为：乙肝治疗的根本目的在于长期持续抑制病毒复制，阻本目的在于长期持续抑制病毒复制，阻止疾病进展止疾病进展•我国乙肝的流行现状•高敏PCR监测在慢乙肝治疗中的应用价值及现状•新型国产高敏PCR检测技术的性能评价主要内容抗乙肝病毒药物的研发进展抗乙肝病毒药物的研发进展1992干扰素被批准 慢乙肝治疗1998拉米夫定200320052007Peg干扰素阿德福韦恩替卡韦替比夫定2008替诺福韦2014替诺福韦中国慢乙肝的抗病毒治疗慢乙肝的抗病毒治疗• 基于IFN的治疗基线特征指导的治疗(BGT)治疗应答指导的治疗(RGT)• 基于Nuc的治疗初始治疗药物的选择疗效欠佳患者治疗方案的优化（线路图）抗病毒治疗无异于病人的二万五千里长征！抗病毒治疗无异于病人的二万五千里长征！十一五前路线图（优化治疗）是个传说；十一五路线图（优化治疗）变成现实并有了路标；十二五延安 遵义那么，万里长征的路标是什么？那么，万里长征的路标是什么？慢乙肝常用实验室诊断与监测指标慢乙肝常用实验室诊断与监测指标Markers of the virusHBV DNAHBeAgHBsAgcccDNAMarkers of liver damageALTASTBilirubinAntibodies to the virusAnti-HBc, Anti-HBc-IgMAnti-HBeAnti-HBsSeverity of liver damageBilirubinAlbuminProthrombin time不同路标提供不同的诊断和治疗监控信息不同路标提供不同的诊断和治疗监控信息诊断、诊断、 监测监测启动治疗启动治疗鉴别鉴别 初始应答初始应答预测预测 治疗应答治疗应答监测耐药监测耐药证明证明 持续应答持续应答HBsAgHBsAgHBsAgHBsAg定量定量抗抗- -HBsHBsHBeAgHBeAg抗抗- -HBeHBe抗抗- -HBcHBcHBV DNAHBV DNAALTALTModified from Pawlotsky et al. Gastroenterol 2008HBV DNA路标的临床意义路标的临床意义• 评价疾病活动程度（活动与非活动：疾病风险预测）• 筛查抗病毒治疗的对象：判断治疗起点• 优化抗病毒治疗及疗效评估启动抗病毒治疗时的监测治疗过程中的监测（长征路）耐药性监测肝癌与肝硬化患病风险研究肝癌与肝硬化患病风险研究: : 准确的基线HBV DNA检测有助于风险评估≥ 1 Million100,000- 999,999基线基线 HBV DNA (copies/mL)Patients (%)Cumulative Incidence of HCC at Year 13 Follow-up[1](N = 3653)504030201001.31.43.612.214.9Cumulative Incidence of Cirrhosis at Year 13 Follow-up[2](N = 3582)4.55.99.823.536.24 log4 log替比夫定拉米夫定乙肝病毒核酸载量乙肝病毒核酸载量PCR检测的国际指南检测的国际指南• 谁需要检测– HBsAg阳性患者和HBsAg阴性的高危人群– 携带者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者• 什么时候检测– 未治疗患者、治疗前、治疗中、结束治疗后均需检测国际乙肝治疗指南对国际乙肝治疗指南对HBVDNA定量定量PCR要求要求Hepatology, 2009 J Hepatol, 2012国际乙肝治疗指南对国际乙肝治疗指南对HBVDNA定量定量PCR要求要求• 超敏感（Hypersensitivity）—HBV最低检测限＜10-15 IU/ml• 宽线性范围（ wider dynamic range ）—涵盖101~109IU/ml• 高特异性（ High specificity）• 可重复性好（ Repeatability）—（操作简单，或可自动化）国外国外HBV DNA 检测试剂性能的比较检测试剂性能的比较Abbott RealTime HBV1021041031051061071081010109101 HBV DNA (IU/mL)HBV Digene Hybrid-Capture IHBV Digene Hybrid-Capture II Ultra-Sensitive Digene Hybrid-Capture IIAmplicor HBV MonitorCobas Amplicor HBV MonitorVersant HBV DNA 1.0Versant HBV DNA 3.0Cobas Taqman 48 HBVHBV PCR KitTMA Assay LLQ 5 IU mL过去国内过去国内HBV DNA定量试剂灵敏度定量试剂灵敏度及线性范围及线性范围比较比较原有国产原有国产（鲁凤民，乙型肝炎实验室诊断的研究进展）国内国内HBV DNAHBV DNA定量检查的现状定量检查的现状• 目前国内生产的乙型肝炎病毒目前国内生产的乙型肝炎病毒DNA定量定量PCR试剂有很试剂有很多种，基本上采用多种，基本上采用煮沸法热变性煮沸法热变性提取提取DNA。

• 存在的问题：存在的问题：检测灵敏度低检测灵敏度低特异性、定量准确性差特异性、定量准确性差线性定量范围窄线性定量范围窄低病毒载量和高病毒载量的检测困难低病毒载量和高病毒载量的检测困难•我国乙肝的流行现状•高敏PCR监测在慢乙肝治疗中的应用价值及现状•新型国产高敏PCR检测技术的性能评价主要内容圣湘圣湘Natch S全自动核酸提取系统全自动核酸提取系统+磁珠法磁珠法HBV定量定量PCR检测试剂性能评价检测试剂性能评价新型国产新型国产HBV DNAHBV DNA检测试剂的质量评价检测试剂的质量评价• 考评试剂：湖南圣湘公司的高敏感HBV DNA检测试剂• 参比试剂：罗氏罗氏 (COBAS 2.0)• 进行试剂的实验室质量评价，包括试剂的可溯源性、准确度、精密度等考评（（北京大学感染病中心北京大学感染病中心、北京佑安医院、中南大学湘雅医院）、北京佑安医院、中南大学湘雅医院）1.定量检测定量检测HBV感染者血浆感染者血浆(清清) HBV DNA是了解肝内是了解肝内HBV复制水平的可靠复制水平的可靠指标，也是指标，也是HBV感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标。

2.目前我国市场上主流的国产目前我国市场上主流的国产HBV DNA定量试剂盒多是基于即将废除的定量试剂盒多是基于即将废除的煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为500~1000 IU/ml，不能满足临，不能满足临床诊断的需求多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质床诊断的需求多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距试剂相比，仍存在较大差距3.在国家“十一在国家“十一.五”和“十二五”和“十二.五”传染病防治重大专项等国家项目的支五”传染病防治重大专项等国家项目的支持下，基于磁珠法核酸提取的国产持下，基于磁珠法核酸提取的国产HBV DNA定量试剂盒已成为主流定量试剂盒已成为主流研发方向研发方向研究背景研究背景1.对对WHO的的HBV DNA标准品的可标准品的可溯源性分析溯源性分析：确定：确定试剂盒检测的可靠性试剂盒检测的可靠性2.对对HBV B和和C基因型标准血浆检测的基因型标准血浆检测的重复性分析重复性分析：：比较其准确度和精密度比较其准确度和精密度3.对对临床血清盘临床血清盘的检测结果分析：评价其相关性和的检测结果分析：评价其相关性和符合率符合率研究方法研究方法罗氏罗氏 COBAS罗氏罗氏 COBAS Version 2.0雅培雅培 Realtime HBV DNA湖南圣湘湖南圣湘 新型新型HBV DNA kit样本用量样本用量850μl 500μl 200μl 或或 500μl 200μl 核酸提取方法核酸提取方法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法检测下限检测下限 (LOD)12 IU/mL (EDTA 血浆血浆 )9 IU/mL (EDTA 血浆血浆) 或或 19 IU/mL(血清血清)10 IU/mL或或 15 IU/mL(EDTA/ACD血血 浆、血清浆、血清)10 IU/mL(血清血清)线性范围线性范围54.5-1.1××108 IU/mL20-1.7××108 IU/mL10-1.0××109 IU/mL(500μl ) 15-1.0××109 IU/mL(200μl) 20-2.0××109 IU/mL临床特异性临床特异性100%100%>99.5%100%适用基因型适用基因型基因型基因型A-G基因型基因型A-H, 包括包括 pre- core 突变突变基因型基因型A-H基因型基因型A-H储存条件储存条件2-8 ℃℃2-8 ℃℃-20℃℃ or colder核酸提取试剂核酸提取试剂2-8 ℃℃；； 扩增反应试剂扩增反应试剂-20±±5℃℃ 。

有效期有效期18 个月个月25 个月个月12个月个月18个月个月圣湘试剂和国际主流试剂的主要参数比较圣湘试剂和国际主流试剂的主要参数比较WHO genotype A2 PanelRoche COBAS 2.0SansureRep 1Rep 2Rep 3Rep 1Rep 2Rep 3Day 1:Day 2: repeat the above testing patternDay 3: repeat the above testing patternNIBSC：英国国家生物标准与检定所：英国国家生物标准与检定所WHOWHO标准血清盘可朔源性检测方案标准血清盘可朔源性检测方案可朔源性分析结果可朔源性分析结果试剂试剂理论值理论值 (IU/ml)理论值理论值 (lg IU/ml)实测值实测值 (lg IU/ml)相对偏差相对偏差 (lg IU/ml)标准差标准差 (lgIU/ml)圣湘圣湘 (PCR-荧光探针法荧光探针法)501.6991.524-0.1760.2072002.3012.119-0.1820.20520003.3013.126-0.1750.09520 0004.3014.145-0.1560.103罗氏罗氏 (COBAS 2.0)501.6991.579-0.1210.0292002.3012.056-0.2450.。