PTEN、pERK和pAKT在中耳胆脂瘤上皮中的表达和意义.pdf

P T E N 、p - E R K 和p - A K T 在中耳胆脂瘤上皮中的表达和意义E x I ：a n d “ g n i f i c a n c eo fP T E N ，p ．E R Kanresslona n os l g n l t l c a n c eOa nE 州，p —K KP - - A K Ti nc h o l e s t e a t o m ae p i t h e l i u m导一级学科：二级学科：论文课题起止时间：2Q ! ! 生12 旦二2Q12 生2 旦论文完成时间：至Q ! 至生兰月中国医科大学( 辽宁)20 12 年3 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任论文作者签名：础璺趁‘日期：立2 垒：；中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。

本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文论文作者签名：指导教师签名：日期：目录一、摘要中文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“1英文论著摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”3二、英文缩略语⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”5三、论文肖f 言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“6 0日I J 舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1 3讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 1结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2 9四、本研究创新性的自我评价⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 0五、参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31六、附录综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3 6致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·4 3个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4 4·中文论著摘要·P T E N 、P ．E R K 和P ．A K T 在中耳胆脂瘤上皮中的表达和意义目的检测蛋白酪氨酸磷酸酶基因( P T E N ) 、磷酸化A K T ( P - A K T ) 和磷酸化E R K ( P ．E R K ) 在人类中耳胆脂瘤上皮的表达情况及其相关性，探讨它们在中耳胆脂瘤形成机制中的重要作用。

方法应用免疫组织化学染色法检测4 0 例中耳胆脂瘤标本及1 5 例正常皮肤标本中P T E N 、P ．A K T 和P ．E R K 蛋白的表达应用W e s t e r nb l o t 免疫印迹法检测其中2 0例中耳胆脂瘤标本和1 0 例正常皮肤标本P T E N 、P ．A K T 和P ．E R K 蛋白以及内参G A P D H 的表达量结果免疫组化显示，P T E N 在胆脂瘤和正常皮肤中的细胞核及胞浆均有着色核P T E N 在胆脂瘤的阳性表达率为2 7 ．5 ％，明显低于正常皮肤中的6 6 ．6 ％( P 5 0 ％细胞着色为3 分最后将染色强度计分和百分比计分相乘之积作为该样本评判标准，得分为0 ．2 分者为阴性样本( 一) ，3 分或以上者为阳性样本( + ) 二) W e s t e r nb l o t 免疫印迹法检测各个目的蛋白的表达1 、提取蛋白方法：组织洗涤后加入3 倍体积预冷的P B S ，0 ℃研磨，加入1 25 x S T O Pb u f f e r ，1 8 0 W ，6 m i n s ，0 “ C 超声波破碎，5 0 0 0 r p m ，5 m i n s 离心，取上清。

加入1 3 - M E ( 9 ．5 m l 加入0 ．5 m 1 ) ，溴酚蓝( 9 ．5 m l 加入0 ．5 m 1 ) 煮沸1 0 m i n ，分装后于．2 0 ℃保存，用时取出，直接溶解上样2 、电泳：根据目的蛋白的分子量，配制1 0 ％S D S —P A G E 胶垂直电泳，根据蛋白浓度调整上样量，保持每孔4 0 0 9 蛋白上样，先采用电压9 0 V ，l 小时浓缩样品蛋白，再采用电压1 2 0 V ，9 0 m i n 电泳分离样品蛋白3 、转膜：电泳结束后，P V D F 膜先后要在1 0 0 ％甲醇里浸泡1 0 分钟、去离子水中浸泡2 0 分钟，接着将海绵、滤纸、凝胶、P V D F 膜一起放在转膜缓冲液中浸泡1 0 m i n ，按照“海绵一滤纸一凝胶一P V D F 膜一滤纸一海绵”依次顺序装放好转膜装置( 膜靠正电极一边) 按恒压1 0 0 V 电转移1 4 0 m i n 到P V D F 膜上4 、封闭和一抗孵育：用5 ％脱脂奶粉常温下封闭摇床l h ，P B S 液洗膜3 次，每次1 5 m i n ，然后加入按说明书要求稀释的兔抗人P T E N 、P ．A K T 、P ．E R K 和内参G A P D H 抗体，于4 。

C 孵育过夜5 、二抗孵育：T B S T 液洗膜3 次，每次1 5 m i n ，加入按说明书要求稀释的H R P标记羊抗兔二抗，室温下摇床m 6 、显影：T B S T 液洗膜3 次，每次1 5 m i n ，用E C L 显色液显色，定影液终止显色7 、各实验重复3 次六、数据分析及统计学处理应用S P S S l 5 ．0 统计软件包对数据进行统计学处理，计数资料的差异比较采用X 2 检验( 卡方检验) ，计量资料的差异比较用两样本t 检验，运用S p e a r m a n 检验来判断P T E N 、P ．A K T 和P ．E R K 蛋白表达之间的相互关系( 相关性分析) ，以P < 0 ．0 5为差异具有统计学意义结果一、免疫组化s p 法检测各蛋白的表达( 图1 ．1 2 )( 一) 核P T E N 蛋白在中耳胆脂瘤和正常皮肤中的表达核P T E N 在胆脂瘤和正常皮肤的上皮层细胞核着色，以基底层和基底上细胞1 3层为主4 0 例中耳胆脂瘤标本中有1 1 例为阳性标本1 5 例正常皮肤中l O 例为阳性标本P B S 缓冲液代替一抗的阴性对照片不着色中耳胆脂瘤标本阳性率为2 7 ．5 ％；正常皮肤组阳性率为6 6 ．7 ％( 图1 3 ) 。

图1 3 ．中耳胆脂瘤组和正常皮肤组核P T E N 阳性标本率( 二) 质P T E N 蛋白在中耳胆脂瘤和正常皮肤中的表达质P T E N 在胆脂瘤和正常皮肤的上皮层细胞浆着色，以基底层和基底上细胞层为主4 0 例中耳胆脂瘤标本中有2 1 例为阳性标本1 5 例正常皮肤中1 3 例为阳性标本P B S 缓冲液代替一抗的阴性对照片不着色中耳胆脂瘤阳性标本率为5 2 ．5 ％；正常皮肤阳性标本率为8 6 ．6 ％( 图1 4 )图1 4 ．中耳胆脂瘤组和正常皮肤组质P T E N 阳性标本率( 三) P ．A K T 蛋白在中耳胆脂瘤上皮和正常皮肤中的表达P ．A K T 在胆脂瘤和正常皮肤的上皮基底层和基底上细胞层胞质中着色，有时亦伴有胞核着色4 0 例中耳胆脂瘤标本中有2 9 例为阳性标本，阳性率为7 2 ．5 ％，1 5 例正常皮肤中有4 例为阳性标本，阳性率为2 6 ．7 ％( 图1 5 ) P B S 缓冲液代替一1 4抗的阴性对照切片不着色图1 5 ．中耳胆脂瘤组和正常皮肤组P - A K T 阳性标本率( 四) P —E R K 蛋白在中耳胆脂瘤上皮和正常皮肤中的表达P ．E R K 染色主要位于细胞核，4 0 例中耳胆脂瘤标本中有3 3 例为阳性标本，阳性率为8 2 ．5 ％，分布于胆脂瘤上皮全层，1 5 例正常皮肤中有4 例为阳性标本，阳性率为2 6 ．6 ％( 图1 6 ) 。

P B S 缓冲液代替一抗的阴性对照片不着色图1 6 ．中耳胆脂瘤组和正常皮肤组P ．E R K 阳性标本率( 五) 中耳胆脂瘤上皮组织和正常皮肤组织之间P T E N ，P ．A K T 及P ．E R K 蛋白表达情况的比较l 、组间核P T E N 蛋白表达情况的比较中耳胆脂瘤组和正常皮肤组的核P T E N 阳性标本率分别为2 7 ．5 ％和6 6 ．6 ％，两者差异具有统计学意义( P < O ．0 1 ) ，见表l 表明在中耳胆脂瘤中，核P T E N 的表达明显下降，而核P T E N 对E R K 通路有抑制作用，其蛋白的表达下降或缺失将导致P ．E R K 的活性增加，从而促进胆脂瘤上皮细胞异常增殖1 5表1 ．组间核P T E N 蛋白表达情况的比较组别总例数阳性例数阴性例数阳性率( ％)中耳胆脂瘤组4 01 12 92 7 ．5正常皮肤组1 51 056 6 ．6注：( 1 ) 统计方法为四格表卡方检验( X 2 = 7 ．0 9 0 ，P = 0 ．0 0 8 )( 2 ) 中耳胆脂瘤组和正常皮肤组核P T E N 阳性标本率差异有统计学意义∞0 ．0 1 )2 、组间质P T E N 蛋白表达情况的比较中耳胆脂瘤组和正常皮肤组的质P T E N 阳性标本率分别为5 2 ．5 ％和8 6 ．6 ％，两者差异具有统计学意义( P < 0 ．0 1 ) ，见表2 。

表明在中耳胆脂瘤中，质P T E N 的表达明显下降，而质P T E N 对P 1 3 k ／A K T 通路存在抑制作用，其蛋白的表达下降或缺失将导致P ．A K T 的活性增加，从而抑制胆脂瘤上皮细胞凋亡表2 ．组间质P T E N 蛋白表达情况的比较组别总例数阳性例数阴性例数阳性率( ％)中耳胆脂瘤组4 02 11 95 2 ．5正常皮肤组1 51 328 6 ．6注：( 1 ) 统计方法为四格表卡方检验( X 2 = 1 9 ．6 1P = O ．0 0 4 )( 2 ) 胆脂瘤组和正常皮肤组质P T E N 阳性标本率差异有统计学意义( P < 0 ．0 1 )3 、组间P ．A K T 蛋白表达情况的比较中耳胆脂瘤组和正常皮肤组的P ．A K T 阳性标本率分别为7 2 ．5 ％和2 6 ．7 ％，两者差异具有统计学意义( P < 0 ．0 1 ) ，见表3 表明P ．A K T 作为重要的抗凋亡调节因子，其表达增强可以导致胆脂瘤上皮细胞凋亡受到抑制，从而促进细胞存活，与中耳胆脂瘤的发生有密切关系表3 ．组间P ．A K T 蛋白表达情况的比较．注：( 1 ) 统计方法为四格表卡方检验( X 2 = 9 ．5 4 9 ，P = 0 ．0 0 5 )( 2 ) 中耳胆脂瘤组和正常皮肤组P - A K T 阳性标本率差异有统计学意义p 如．0 1 )4 、组间P ．E R K 蛋白表达情况的比较1 6中耳胆脂瘤组和正常皮肤组的P ．E R K 阳性标本率分别为8 2 ．5 ％和2 6 ．7 ％，两者差异。