纳米磁珠及其在分子诊断中的应用.doc

生化与分子生物学专业《分子诊断技术》课程论文 纳米磁珠及其在分子诊断中的应用 摘要 纳米磁珠（magnetic nanoparticles）是由Senyei A E在1978年首先研制出来 的一种新型的功能材料其内核一般由磁性物质的超细粉末组成，外层常由高分子材料 组成包被壳层纳米磁珠除普通纳米粒子的基本特征外还具有多种生物学功能及磁导向 性和顺磁性，从而便于在磁场下实现分离并能同时对样品进行富集近年来，包被有特 异性抗体、受体和单链DNA等的功能高分子磁性微球逐渐成为生物分析与分子诊断的重 要手段，并被广泛应用于细胞分选、蛋白纯化、免疫分析、核酸分析、生物芯片等多个 领域 关键词：纳米磁珠 免疫磁珠 疾病检测 样品制备 芯片实验室 1.纳米磁珠 1.1 纳米磁珠及其性质 纳米磁珠是具有超顺磁性的纳米微球，粒径大多处于50-800nm之间，最早的人工纳 米磁珠是由Senyei A E在1978年研制出来的它不但具有普通纳米粒子所具有的4个基本 效应（量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和宏观量子效应） ，还具有异常的磁学性质， 如超顺磁性、高矫顽力、低居里温度与高磁化率等特性。

此外，常用的纳米磁珠常连接 有多种活性基团或生物大分子，这些表面修饰又使得纳米颗粒具有多种相应的生物学特 性 图一、常用的磁珠表面修饰基团示意图生化与分子生物学专业《分子诊断技术》课程论文 1.2纳米磁珠的分类 1.2.1生物纳米磁珠 1975 年，Blakemore等首次发现并报道了一种含有纳米级微小磁性颗粒的细菌， 称 之为磁性细菌 [1] 生物纳米磁珠指从磁性细菌体内提取的纳米磁珠 [2] ，该细菌细胞内特有 串状Fe 3 O 4 磁性颗粒利用含铁培养基在封闭培养皿中培养磁性细菌4d后可通过高压限域 滤过处理挤碎菌体获得生物纳米磁珠 [1] 生物纳米磁珠经磁场回收、超声洗涤和包被修饰 后可用于多种生物分析过程 1.2.2 人工纳米磁珠 相对于生物纳米磁珠来说，目前较为常用的是利用物理化学方法人工制备的各种纳 米磁珠市售的各种纳米磁珠也多为人工制备磁珠根据磁珠导向性核层即磁核材料的 不同，大体可分为：1）无机微球：包括主要成分为 Fe 3 O 4 的磁性铁氧化物纳米粒子 [3, 4] 、 主要成分为 SiO 2 的纳米粒子和 Al 2 O 3 纳米微球；2）生物高分子微球：包括葡聚糖微球和 壳聚糖微球等。

市售的聚合物高分子微球是通过单体聚合得到的磁性微球，便于控制微 球粒径和表面活性基团的种类，因而也成为人们研究较多的一种 1.3.2两种磁珠的区别 磁性细菌菌体内的纳米级磁珠颗粒与人工合成的磁珠相比，主要有以下一些优点： （1）磁珠大小较为均匀，为稳定的单磁畴晶体；（2）磁珠表面外包一层天然的生物膜， 可作为化学修饰的靶点或抗原、抗体等生物大分子结合的位点；（3）在溶液中的分散性 能良好，颗粒之间不易聚集；（4）对细胞无任何毒性；（5）有可能实现细菌高密度培 养技术大量生产， 因而成本低廉 1.3纳米磁珠的结构组成 分析中常用的纳米磁珠主要由两部分组成：具有磁导向性的核层（磁核）和具有亲 和性、生物相容性的壳层以磁性铁氧化物纳米粒子为例，其结构一般有 4种类型即核- 壳型、镶嵌型、壳-核型和壳-核-壳型(图 2)核-壳型一般是磁性铁氧化物纳米粒子组成核， 有机分子材料组成壳层；镶嵌型多是磁性铁氧化物纳米粒子均匀地镶嵌于有机分子微球 的孔穴中；壳-核型是有机分子材料为核， 磁性铁氧化物纳米粒子组成壳层；壳-核-壳型 是结构的外层和内层均为有机分子材料，中间层为磁性铁氧化物纳米粒子吸附或键合在生化与分子生物学专业《分子诊断技术》课程论文 其中 [3] 。

图二、有机分子功能化的磁性铁氧化物纳米粒子结构图 2.纳米磁珠的应用 2.1利用纳米磁珠进行核酸样品制备 纳米磁珠作为一种新型纳米材料具有巨大的比表面积，能特异吸附核酸样品而不能 吸附蛋白质等杂质 [5] 因而可以利用纳米进行核酸样品的制备并将核酸的分离与富集过程 有机结合起来 [6] 是一种操作简便、快速高效的制备方法，且得到的样品可以直接在磁珠 上进行 PCR 扩增，可以省略洗脱过程，但不会影响扩增效率 2.1.1血液样本的核酸提取 在临床诊断中，常从人体组织，如血清或血浆、组织切片等中分离纯化DNA，然后 用于疾病的诊断以及组织配型全血因为方便易得，所以是临床分子诊断中主要DNA样 品的主要来源 [7] 目前，用以分离纯化基因组DNA的方法较多，最经典的方法就是SDS- 蛋白酶K/苯酚-氯仿法（简称酚-氯仿法） 该方法中需用蛋白酶K消化，耗时长且酚和氯 仿对人体有害，且易造成环境污染，同时提取过程需要反复抽提，步骤繁琐，易造成 DNA的丢失和样本污染 [8] Xin Xie [7] 等利用纳米磁珠对全血中的白细胞进行了富集并获得了较好的核酸样品该 方法无需反复离心取上清，只需在同一体系内最终将样品洗脱即可，另外由于蛋白质和 色素等其它杂质不能与磁珠结合，所以制得的样品中不含对PCR扩增过程有抑制作用的各 种杂质，便于进一步检测分析。

2.2.2质粒的提取 常规的质粒提取过程需要多次离心、沉淀和层析，既不利于自动化也容易对核酸造 成破坏Shan Zhi 等 [9] 利用异丁烯酸为壳层的 Fe 3 O 4 磁性微球对大肠杆菌质粒进行了提取 结果与当时商业化试剂盒不相上下，但由于无需离心、沉淀等步骤，该方法耗时不到 20生化与分子生物学专业《分子诊断技术》课程论文 分钟，价格也要便宜很多此外该方法操作简单，便于在芯片实验室（lab on a chip）中 使用 2.2.3割胶回收 常规割胶回收常利用酚或各类试剂盒，不但操作繁琐回收产量无法保证，且部分试 剂也对人体有害利用纳米磁珠对核酸的特异吸附可以类似核酸提取过程对凝胶中的特 定片段大小的核酸样品进行回收该方法耗时短，样品损失小，价格也要低廉一些 Saiyed 等 [10] 就利用这种方法对质粒琼脂糖凝胶进行了回收，结果显示质粒的回收率达到 80%以上，且酶切结果正常，说明该方法也不会引入各种限制性内切酶抑制剂，是割胶回 收的理想方法 2.2免疫磁珠 免疫磁珠由载体微球和免疫配基结合而成载体微球的核心为金属小颗粒（Fe 3 O 4 ） ， 核心外包裹一层高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯） ，最外层是功能基层（如氨基、羧 基、醛基、羟基等） 。

由于载体微球表现物理性质不同，可结合不同的免疫配基，如抗体、 受体、寡核苷酸链 [11] 等形成磁性生物材料，从而具有了靶向结合目标分子的能力 [12] 2.2.1免疫磁珠检测的优点 传统的检测方法操作复杂、需时较长（一般需数天至数周） ，且不适于检测难培养或 不可培养的细菌、病毒免疫磁珠法不但操作安全简便、用时短、适用于绝大多数，而 且可以反应病毒或者细菌的感染性 [13] 2.2.2免疫磁珠的制备 将0.4 mL3-氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7 h对磁 珠进行氨基化修饰然后，利用外加磁场将APTES修饰的磁性颗粒从反应介质中分离并 用乙醇溶液清洗5次将氨基化复合颗粒加入到50mL质量分数为3%戊二醛的磷酸缓冲溶 液（PBS）中，37℃搅拌3h后，用PBS溶液清洗3次取400μL磁珠，加5mL抗体（用 Na 2 CO 3 - NaHCO 31：500稀释)，37℃振荡反应2 h用Na 2 CO 3 -NaHCO 3 清洗3次这样就制 得了用特定抗体修饰的免疫磁珠，并可用于特定细菌、病毒的检测 [12] 2.2.3 特定细菌、病毒的检测 目前， 低浓度的目标病毒或病原菌， 尤其是混杂在其他细菌混合液中的病原菌， 生化与分子生物学专业《分子诊断技术》课程论文 以及近年来被广泛认知的“活的非可培养状态”的人畜共患病原菌， 由于检测方法的局限 性， 检出率低， 漏检率较高 [1] 。

免疫磁分离技术（IMS）作为一种新型的免疫分离技术 现已广泛应用于于医学、生物分离、食品卫生检测、环境检测等诸多领域，利用该技术 可以快速地检测食品、环境和临床样本中的目标微生物和致病菌，为细菌的有效监控提 供了新的检测技术 [14] Cudjoe [15] 及王海明 [14] 等利用免疫磁分离技术对食物中的沙门氏菌进行了检测，结果 表明利用该方法检测限可达到1-10cfu/25g，并将常规检测方法中的72小时检测周期缩短至 40小时，同时有效减轻过程交叉污染筛选结果既可以与常规的细菌生化和血清学联用， 也可以和显色培养基、荧光以及微生物全自动鉴定仪器等方法联用 Antti Valanne等 [16] 将铕修饰的纳米磁珠和96孔板用乙肝病毒单克隆抗体包被后通过两 个不同抗原决定簇的抗原抗体反应对血液样品中的乙肝病毒进行检测，检测结果与Elisa 检测一致，但整个检测过程仅仅需要10分钟这为临床检测提供了极大的便利 Yu [17] 和Irwin P [18] 等则分别利用免疫磁珠分离技术对常见禽类体内的空肠弯曲杆菌和 通过食物传播的多种细菌进行了捕获分离与研究 可见经过特定修饰的纳米磁珠目前在微生物检测方面有着广泛的应用。

2.3纳米磁珠检测特定序列DNA 上述纳米磁珠的生物学特性不禁让我们想到可以利用修饰后的磁珠与寡核苷酸探针 相结合，然后通过磁珠的超顺磁性简便的捕获特定序列的DNA事实上，科学家早已利 用Fe 3 O 4磁性颗粒进行羧基化修饰后用偶联试剂1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺 （EDC）和N -羟基琥珀酰亚胺（NHS）在磁珠表面共价固定寡聚核苷酸（其5’端修饰了 氨基）作为探针，用于检测与其碱基序列互补的DNA [19] 陈照立等 [20] 利用该技术与AFLP技术来检测体内二羟环氧苯并芘-DNA复合物并为筛 选二羟环氧苯并芘致癌相关基因提供了条件结果证明，AFLP结合免疫磁珠分离技术可 以富集分离BPDE2DNA 片段，作为筛选BPDE致癌相关的特异或易感基因的一种方法 Liang等 [21] 将银/二氧化硅磁珠用拉曼标签标记并连接寡核苷酸探针后，对HIV基因进 行了检测，结果也显示出相当高的选择特异性和灵敏度 2.4芯片检测 自从1991年Affymetrix公司生产第一块原位合成的基因芯片，1994年斯坦福大学用点生化与分子生物学专业《分子诊断技术》课程论文 样法制备的第一块微阵列cDNA芯片以来，基因芯片技术在人类基因组计划的推动下得到 了迅速发展。

目前常用的检测标记方法有同位素、酶类、抗原、荧光素等 [22] ，其中荧光 标记具有种类多、灵敏度高等优点，是最为常用的标记手段但是荧光标记的芯片检测 有较高仪器要求，成本高且检测结果不能长期保存近些年来，新兴的金纳米颗粒标记 法则需要银染等步骤，操作繁琐，耗时多科研工作者利用纳米磁珠具有超顺磁性便于 在磁力下操作的特点，利用链霉亲和素包被磁珠并对生物素标记的核酸样品进行检测 该方法杂交结果肉眼可见，对设备要求低，方便、快捷，耗时仅4-8小时（含核酸提取过 程） [23] 王聿佶等 [24] 正是利用基于纳米磁珠的新型微全分析DNA芯片实现了在同一芯片上完 成样品预处理、DNA提取、DNA扩增和检测的全过程，不得不说纳米磁珠在这几个过程 中的应用为科研提供了新的手段和思路，也大大节约了所需的时间和成本这种基于纳 米磁珠的芯片还可以应用于便携仪器中这将成为生物芯片检测全自动化的芯片实验室 中一种非常有应用前景的方法 3.问题与展望 前面介绍了纳米磁珠作为新型纳米基质材料在分子诊断领域的多种应用，也让我们 认识到纳米磁珠技术的诸多优势所在，但这并不意味着纳米磁珠技术已经不存在任何问 题作为刚刚发展起来的一项诊断技术，其应用还不是非常广泛，且磁珠本身的制备和 修饰、包被过程中也存在一些亟待解决的问题，如磁珠巨大的比表面积使其具有强烈的 聚集倾向、与其它材料的相。