荧光定量PCR 法原理汇总.docx

我们前面比较详细地介绍了荧光染料法做定量PCR的有关技术和产品，显然， 作为定量PCR的初期阶段的荧光染料法还是有局限性的，比如，由于染料不能区 分特异性PCR产物和引物二聚体等非特异产物，也不能区分不同探针，所以检测 的特异性始终不如后来出现的探针法；需要在PCR后进行熔链曲线分析；也不能 做多重PCR检测(Multiplex)上个世纪90年代原美国Perkin Elmer( PE)公司开发出了 Taqman荧光探针 定量技术，将定量PCR带入了更广阔的应用空间Taqman探针法的出现是定量 PCR技术的重要里程碑，之后在此基础上发展出了杂交探针法，以及荧光引物法， 是对探针法的不断改进和简化如果希望全面掌握定量PCR技术的研究人员就不 能错过这些定量检测技术要提到荧光探针或者荧光引物，有一个基础概念需要首先明确，那就是荧光 共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 一 对合适的 荧光物质可以构成一个能量供体(donor)和能量受体(acceptor)对，其中供 体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到一定距离 (1—10 nm)时，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发 射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。

能量传递的效率和供体的发 射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体 与受体之间的距离等有关定量PCR所涉及的荧光探针和荧光引物的检测都这个 FRET原理相关实时荧光PCR中另一个很重要的概念，即Ct值.C代表循环(Cycle)，T代表 阈值(Threshold).Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历 的循环数.一般取PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光 阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍研究表明，每个模 板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存性关系，起始拷贝数越多，Ct值 越小利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线.因此，只要获得未知样品 的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数一：水解探针法TaqMan技术原理：除了一对特异性引物，TaqMan探针法增加一条和模版互补的基因 特异性探针（通常20—30bp），探针上5'端和3'端分别标记了一个报告荧 光基团（供体）和一个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整） 时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测 不到供体荧光信号；而当PCR过程中Taq DNA聚合酶扩增到探针结合模 版的位点时，其5'-3 '核酸外切酶的活性（也就是切口平移）切割掉探针5' 端的报告基团一一游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发 报告基团产生的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。

这样每扩增一条 DNA链，就对应有一个游离的荧光分子（报告基团）形成，保证了荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进行检测就可以实 时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数但是实际上探针较长 使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，而且淬灭基团也会产生 不同波长的荧光，都会使得本底偏高.MGB原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司 技术 推出了一种新 TaqMan探针 MGB探针（minor groove binderoligodeoxynucleotide conjugate, MGB-ODN），3'端采用了非荧光性 的淬灭基因一一淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本 底信号的干扰此外，MGB探针的3'端还连接了一个二氢环化吲噪卟啉- 三肽（dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3 ）可以大大稳定探针 与模板的杂交，升高探针Tm值，使较短的探针同样能达到较高的Tm 值一一而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好， 荧光背景更低，使得信噪比更高：一个15bp的MGB探针的信噪比大于 6,优于理想状态下的25bp的普通Taqman探针（信噪比约为1.5）。

允许 采用更短的探针也简化了探针的设计和成本有实验证明MGB探针对于 等位基因的区分比较理想，甚至可以检测单碱基突变（因为碱基错配对较短 探针的杂交稳定性影响更大）水解探针之所以称之为水解，主要是因为它利用的是Taq酶的水解作用，使得 探针上的荧光报告基团远离淬灭基团而发光信号，游离的报告基团数目对应PCR 新扩增产物，此方法检测的是积累荧光优点：灵敏，特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步 提高的定量PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪 器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的 专一性有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管 内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响缺点：探针设计有一定难度，需要验证效果，探针的合成和双荧光标记成本高此外，也有人认为，Taqman法利用了 Taq酶的外切活性，而由于各家公司 出产的Taq酶对于其外切酶活性并没有做出严格的活性标定，定量PCR的效率有 可能受酶外切活性的影响，酶活性差异也给定量带来了不确定性。

至少，生物通 定量PCR技术系列前面介绍的Stratagene 2100万美元专利之争的Fullvelocity DNA聚合酶由于去掉外切酶活性，就不能用于Taqman探针法了！应用：Taqman技术广泛应用在人类传染病诊断和病原定量上，在动物疾病病原 体基因的检测、畜禽产品的检验检疫、生物制品的鉴定以及在疫苗效力测定上等 方面都有成功的许多例子注意：1）探针长度应在15-45bp（最佳20-30bp）左右，以保证结合的特异性2） GC碱基含量在40%-60%，避免单核苷酸序列的重复3）避免与引物发生杂交或 重叠4）探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探 针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5°C另外，探针的浓度，探针与模板序列 的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响另外，在仪器的选择上也要 注意，尽量选择具有4色或以上的荧光检测通道的仪器，已保证你的机器的适用 性和试剂选择的灵活性毕竟技术是在快速发展的二：杂交探针法FRE原理：罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针，或者LightCycle探针FRET技术探针由两条和模版互补、且相邻的特异探针组成（距离1—5bp），上游探 针的3'端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5'端标记Red 640受体荧 光基团。

当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体 基团紧密相邻（距离1—5bp），激发供体产生的荧光能量被Red640基团 吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光当变性 时，两探针游离，两基团距离远，不能检测至640波长的荧光FRET探针 检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量， 非累积信号，可以用于做Tm曲线和SNP检测常用的受体荧光基团除了 LC-Red640还有LC-Red705两个单标记探针的长短不影响信号的传 递，而探针间的距离通常为1-5bp （虽然越短越好，还是要留点空间避免 相互之间的反应）我们前面提到，Taqman水解探针法中，一但报告基团水解离开淬灭基团，就 一直游离于反应体系中可被检测，所以检测的是累积荧光，是不可逆的杂 交探针不同，是复性时两条特异探针杂交到模板上，相互靠近而产生检测信 号，到升温变性探针远离模版就没有信号，所以检测的是实时信号，是可逆 的，所以可以进行熔解曲线的分析，还可以用于进行突变分析，SNP基因分 型以及产物鉴别比如一旦探针位置上出现有点突变，通过熔解曲线就可以 很快分析出来，这也是Taqman法无法做到的。

另外，由于采用2条模版特异 的探针，杂交探针法的专一性无疑更高于其他方法，不受非特异产物的影响 Fret探针法由于需要合成2条探针，探针的末端要封闭以避免反应，所以合 成的成本会比较高，也比较麻烦但实 际 上，Fret探针的设计其实比Taqman 探针容易，因为Taqman探针要求一定的长度以保证探针的特异性和结合模版的 能力，但是长度会导致两末端的荧光基团距离远而使得荧光共振能量传递的效率 降低，淬灭不彻底Fret探针就不受这个限制不管怎么说，多数人还是习惯 认为单探针比合成2条探针要简单在水解和杂交探针技术之间产生另外一种技术：分子信标（分子信标产生时 间是1996年）分子信标技术原理：分子信标（Molecular beacon，MB）是一种呈发夹结构的茎环双标 记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标 记在另一端的淬灭基团紧紧靠近荧光基团被激发后产生的光子被淬灭剂淬 灭，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来分子信标的茎环结构中，环一般为15-30bp （有人认为18-20个bp较好）长， 并与目标序列互补，茎一般5-7bp长（GC含量较高），相互配对形成茎的结 构。

荧光基团标记在探针的一端，而淬灭剂则标记在另一端在复性温度下， 因为模板不存在时形成茎环结构，当加热变性会互补配对的茎环双链解开，如 果有模板存在环序列将与模板配对与模板配对后，分子信标将成链状而非发 夹状，使得荧光基团与淬灭剂分开当荧光基团被激发时，淬灭作用被解除， 发出激发光子应用：应用于基因定量分析和突变体识别、疾病基因检测与诊断、单核苷酸多 态性（single nucleotide polymorphism , SNP）分析等生物医学基础和临 床研究中优点：本底低，特异灵敏缺点：①杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性较差②探针合成时标记较复杂延伸技术：建立在分子信标技术基础上的探针技术有Amplifluor、Sunrise、 Amplisensor、Scorpion 等，其中Sunrise技术，这一方法的特点是所有的扩增产物均能标记上荧光分子，因此 荧光信号响应快，但无法区分特异和非特异扩增是其致命的不足Amplisensor技术是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一 探针连接一淬灭物两探针长度不同，其中淬灭物标记探针5’端多出7个碱 基（GCGTCCC）PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物 连接，PCR引物的5’末端应有一段与长探针互补的序列，以便连接酶将该引 物与短探针连接。

扩增时该探针一引物复合物作为半套式引物掺入到模板，从 而释放出淬灭探针部分，破坏了 FRET，而产生荧光Scorpion技术（蝎形引物）则是通过在分子信标的3’端设计连接臂连接一 段引物，使PCR延伸反应时不能够延伸至分子信标，这样非特异扩增产物便 无荧光信号包含发夹结构的PCR产物在退火时形成分子内杂交，发夹结构 被破坏，两个基团之间发生荧光共振能量转移，从而发出荧光这种方法可以 解决非特异的问题，同时灵敏度高，反应快，已应用于k-ras及BRAC2基因 的突变分析了，但这种方法不能保证杂交时探针与模板完全匹配，而且合成复 杂这种技术虽然也是积累荧光（因为结合上模板以后不会掉下来），但是不同于 Taqman水解探针，分子信标可以进行溶解曲线分析，这也就是说分子信标可以 进行包括突变检测，SNP检测等在内的定量PCR延伸应用但是这种技术正如上 面提到的探针设计复杂，稳定性差一一而这一点对于溶解曲线的影响颇大，因此 在应用上也需要审慎考虑第三代：荧光引物Ampl原理：激发的荧光进行分子能量转移到受体成分导致荧光发射的淬灭。