LPS诱导主动脉瓣膜间质细胞成骨分化过程中的作用与机制分析.docx

LPS诱导主动脉瓣膜间质细胞成骨分化过程中的作用与机制分析钙化性主动脉瓣膜疾病(Calcificaorticvalvedisease,CAVD)是一种退行性心脏瓣膜疾病,该病已经成为仅次于冠心病和高血压的第三大心血管疾病瓣膜退行性变引起主动脉瓣狭窄是CAVD发病的主要原因,现在尚没有有效的药物进行治疗与预防,对主动脉瓣狭窄仍主要依赖于外科换瓣手术[1,2],加强主动脉瓣钙化及其机制的研究一直是临床与基础研究的主要热点早期研究认为瓣膜钙化是钙盐被动沉积的结果[3],然而随着研究不断深入,人们逐渐认识到CAVD是一个涉及慢性炎症、内皮损伤、基质重塑、新生血管形成及进展性钙化等复杂变化的主动过程[4,5],炎症性浸润与主动脉瓣组织中的成骨化生变化密切相关[4],并且在主动脉钙化中起重要作用主动脉瓣膜钙化过程中显示有主动脉瓣膜间质细胞(VICs)向肌成纤维细胞分化并继发弥漫性钙化或成骨样分化,且伴有大量凋亡小泡的形成有研究显示在钙化的主动脉瓣膜中不但有TGF-β1(transforminggrowthfactor-β1)表达显著升高[6],并且外源性TGF-β1也可以诱导VICs中骨钙蛋白(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、骨唾液蛋白等骨基质蛋白的表达升高[6,7]。

ERK(extracellularregulatedproteinkinases)作为传递丝裂原信号的信号转导蛋白,是细胞外调节蛋白激酶,包括ERK1和ERK2其可以将信号从细胞表面受体传导至细胞核;在VICs中受到炎症刺激后ERK信号通路激活倾向于正向调节细胞的成骨分化作用[8,9,10]我们采用LPS诱导猪主动脉瓣膜间质细胞(PVICs)的钙化模型,观察TGF-β1及ERK在LPS诱导主动脉瓣膜间质细胞钙化过程中的表达及其意义,从而初步探讨TGF-β1、ERK在LPS诱导主动脉瓣膜间质细胞钙化过程中的可能机制,以期为临床治疗CAVD的防治提供理论依据1、材料与方法1.1材料1.1.1猪主动脉瓣膜间质细胞猪主动脉瓣膜获自重庆市璧山区动物检疫定点屠宰场,现场获取8头8～10月龄雌雄不限的健康家猪,体质量100～120kg处死后,30min内于无菌条件取下健康的主动脉瓣叶,立即保存在4℃的新鲜培养基中(M199),50min内带回实验室进行下步操作1.1.2主要试剂脂多糖(LPS)、茜素红、Ⅱ型胶原酶(美国Sigma)、M199培养基(Hyclone)、澳洲优级胎牛血清(CellMax);兔抗人T-Smad2/3、TGF-β1、OPN(沈阳万类);兔抗人Runx2(SantaCruz);兔抗人p-Smad2/3、TGF-β1R、Bax(北京博奥森);兔抗人p-ERK(1/2)(CST);鼠抗人GAPDH(武汉三鹰);辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔IgG试剂盒(北京中杉金桥);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、化学发光试剂盒(Millipore);Trizol试剂、反转录试剂盒(TaKaRa)、qPCR引物由深圳华大基因公司合成。

碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(碧云天生物科技)1.2方法1.2.1主动脉瓣膜间质细胞的分离、培养取出瓣膜,PBS清洗后无菌棉签刮除瓣膜表面内皮细胞,剪碎后转入Ⅱ型胶原酶中消化,后加入新鲜M199培养基(含1%双抗和10%优级胎牛血清)重悬,铺于培养皿中使其贴壁,细胞生长融合至约80%密度时传代后续实验选用经鉴定明确的第3～6代主动脉瓣膜间质细胞[11]1.2.2LPS诱导PVICs成骨分化及实验分组取对数生长期的瓣膜间质细胞置于标准培养基中进行培养,待细胞密度至30%～50%时加入4μg/mLLPS处理,诱导细胞成骨分化实验分组如下:对照组以常规培养基处理;实验组分别加入4μg/mL的LPS分别持续刺激0、24、48h,检测LPS对瓣膜间质细胞成骨分化诱导效果1.2.3qPCR检测Runx2,OPNOCNmRNA表达Trizol法提取细胞总RNA,两步法反转录成cDNA后进行qPCR扩增引物设计与合成:Runx2上游引物:5′-GCACTACCCAGCCACCTTTA-3′;下游引物:5′-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3′;OPN上游引物:5′-GAGCAAACAGACGATGTGGA-3′;下游引物:5′-GACC-AGCTCATCGGATTCAT-3′;OCN上游引物:5′-TCACA-CTGCTTGCCCTACTG-3′;下游引物:5′-CTA-TGCCATAGAAGCGCCGA-3′;内参GAPDH上游引物:5′-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3′;下游引物:5′-CGTTCA-CTCCGACCTTCACC-3′。

以GAPDH为内参,Q-PCR体系为10μL,反应条件:95℃预变性10min,95℃变性20s,55℃退火10s,70℃延伸1s,循环36次,最后PCR扩增检测OPN,Runx2mRNA水平表达,用2-ΔΔCt法统计分析相对表达量,实验重复3次1.2.4Westernblot检测Runx2,OPN,TGF-β1等相关蛋白表达提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度以250μg为标准计算蛋白上样体积10%SDS-PAGE电泳,蛋白湿转至PVDF膜,封闭,加入一抗(稀释比例Runx2:1∶500,OPN:1∶500,α-SMA:1∶1000,GAPDH:1∶1000),4℃过夜;孵育二抗,显影,ImageLab软件计算出各电泳条带的灰度值,GAPDH作为内参对照,以目的蛋白条带灰度值比对内参条带灰度值代表目的蛋白的表达水平,实验重复3次1.2.5ALP染色检测瓣膜间质细胞碱性磷酸酶活性取对数期生长的细胞种植于24孔板,融合至30%密度时加入不同处理;5%血清常规培养基培养7d,PBS清洗,200μLNBT/BCIP工作液染色,双蒸水终止反应,观察染色结果,室温晾干、拍照1.2.6茜素红S染色检测瓣膜间质细胞钙盐沉积取对数期生长的瓣膜间质细胞种植于24孔板,融合至20%密度时加处理;2%血清常规培养基继续培养14d,PBS清洗,加入0.4%的茜素红染液,显微镜下观察,待出现红色颗粒物质时,吸弃染色液后清洗,显微镜下观察、拍照。

1.3统计学分析采用SPSS20.0统计软件对实验数据进行单因素方差(ANOVA)分析,所有实验数据用x¯±s表示,各组之间差异的两两比较用LSD-t检验2、结果2.1LPS对PVICs成骨分化的影响4μg/mLLPS诱导PVICs成骨分化7d,与空白对照组相比,LPS组碱性磷酸酶活性显著升高;诱导PVICs成骨分化14d,与空白对照组相比,LPS组见明显钙盐沉积(图1A);qPCR检测结果显示:LPS浓度为4μg/mL时,成骨相关基因Runx2和OPN的表达水平较空白对照组显著升高(P<0.001,图1B);4μg/mLLPS诱导PVICs成骨分化7d,晚期成骨相关基因OCN的表达水平较空白对照组亦显著升高(P<0.01,图1C)图1LPS对PVICs成骨分化的影响2.2LPS对PVICs凋亡水平的影响4μg/mLLPS诱导PVICs成骨分化,检测PVICs凋亡水平,Westernblot结果显示:与0h相比,在诱导8h细胞凋亡标志性蛋白Bax表达水平升高,诱导24hBax表达水平升高显著(P<0.05,图2)图2LPS对PVICs凋亡水平的影响2.3LPS对信号通路TGF-β1-Smad2/3的影响用4μg/mLLPS诱导PVICs细胞成骨分化,Westernblot检测TGF-β1及TGF-βR蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,在诱导2hTGF-β1的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),诱导8和24hTGF-β1和TGF-βR的蛋白表达水平均显著升高(P<0.05,图3A、B);Westernblot检测p-Smad2/3蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,p-Smad2/3从2h起蛋白水平逐渐升高,8h升高最为显著(P<0.01),但24h出现下降趋势,而细胞的总Smad2/3蛋白表达量没有明显变化(图3C、D)。

2.4LPS对信号通路ERK的影响4μg/mLLPS诱导PVICs细胞成骨分化Westernblot检测p-ERK蛋白表达水平,结果显示:与空白对照组相比,p-ERK蛋白成升高水平,并且在诱导第8h升高最显著,而细胞的总ERK蛋白表达量没有明显变化(P<0.01,图4)2.5ERK抑制剂对LPS促进PVICs成骨分化的影响4μg/mLLPS诱导PVICs成骨分化7d,与DMSO对照组相比,LPS组碱性磷酸酶活性显著升高;采用ERK信号通路抑制剂(PD98059)预处理30min后再与LPS同时处理PVICs成骨分化7d,与LPS组对比,LPS+PD98059组碱性磷酸酶活性显著降低(图5A);同样,PD98059预处理30min后再与4μg/mLLPS共同处理PVICs细胞成骨分化2d,Westernblot检测蛋白表达水平,结果显示:与DMSO对照组相比,LPS组Bax、Runx2和p-ERK蛋白水平升高(P<0.05),与LPS组相比,LPS+PD98059组Bax、Runx2和p-ERK蛋白表达水平明显降低(P<0.05,图5B、C)图3LPS对信号通路TGF-β1-Smad2/3的影响(n=3,)图4LPS对信号通路ERK的影响图5ERK抑制剂对LPS促进PVICs成骨分化的影响3、讨论目前随着人口逐渐老龄化,CAVD已经成为主要的心血管疾病之一,但是由于对该疾病发病机制的研究尚不清楚,目前除外科手术治疗外尚无有效的治疗药物,因此对该疾病的病生机制和治疗靶点的探索则尤为重要。

瓣膜间质细胞是构成主动脉瓣膜的主要细胞,大量研究表明VICs在主动脉瓣膜退行性变和钙化过程中发挥着重要作用[10,12];目前研究发现,包括慢性炎症在内的多种刺激因素可以诱导VICs逐渐向肌成纤维样细胞和成骨细胞分化,并最终出现钙盐沉积致使瓣膜发生钙化;同样,也有报道指出在主动脉瓣膜钙化早期瓣膜中凋亡水平明显增加[6],但其机制尚不完全明确LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁最外层的类脂多糖类物质,作为慢性炎症中代表物,其可以通过多种途径促进炎症的发生并最终导致瓣膜钙化研究显示,LPS刺激后导致钙化瓣膜中Runx2、BMP-2水平升高[13],BABU等[14]人的研究也发现LPS可以通过增加细胞因子、趋化因子及黏附因子等来刺激VICs出现早期炎症及晚期成骨样改变目前有研究指出,TGF-β1-Smad2/3、MAP激酶(MAPK)、ERK1/2等信号通路参与了VICs细胞在炎性刺激下发生的营养不良变化,凋亡,乃至钙化[10],所以在LPS诱导VICs成骨分化过程中,有关TGF-β1-Smads信号通路和ERK信号通路影响的研究值得探讨以猪主动脉瓣膜间质细胞(PVICs)作为研究对象的原因是猪主动脉瓣膜间质细胞与人主动脉瓣膜间质细胞的同源性最高。

4μg/mL浓度的LPS诱导PVICs成骨分化,通过观察不同时间点细胞碱性磷酸酶活性、钙盐沉积情况以及Runx2、OPN和OCN转录水平的变化,结果发现4μg/mL浓度的LPS可以使PVICs的碱性磷酸酶活性明显升高、钙盐沉积明显增强,并且显著升高成骨相关基因Runx2、OPN和OCN的转录表达水平;提示通过LPS诱导成功构建瓣膜间质细胞成骨分化模型与传统使用钙盐培养基构建PVICs成骨分化模型所不同的是,LPS可以在体外模拟慢性炎症环境对PVICs的影响我们的实验结果提示在LPS诱导PVICs成骨分化过程中可能有TGF-β1-Smads信号通路的参与固定LPS浓度为4μg/mL、不同的时限刺激PVICs,检测TGF-β1信号通路标志物,发现LPS诱导瓣膜间质。