重组门冬酰胺酶II的表达及制备.doc

重组天冬酰胺酶重组天冬酰胺酶 IIII 研究进展研究进展摘摘 要要L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广目前，利用重组 DNA 技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述关键词关键词L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化ⅠⅠ引言引言L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有 30 年了[1][1]L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3） ，此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2][2]由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶） ，而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3][1,3]目前，L-天冬酰胺酶分为 I 型和 II 型，尤其是 II 型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2][2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶 II） 。

天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2][2]本文主要就L-天冬酰胺酶 II 的表达与制备进展进行综述ⅡⅡ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究工程菌的构建，发酵和分离纯化研究1961 年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4][4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5][5]目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1][1]尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6][6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7][7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开1 1．． 表达菌株的构建表达菌株的构建1995 年，为了填补国内空白，刘景晶[8,9,10][8,9,10]等率先进行工程菌E.coli天冬酰胺酶ansB 基因的克隆和表达研究，并首次在国内成功构建了天冬酰胺酶高效表达的基因工程菌pKA/CPU210009；随后他们又在中试过程中优化了工程菌的培养条件和发酵工艺，确定了重组天冬酰胺酶的提纯路线，并进行了产品鉴定。

以上研究结果表明，工程菌发酵单位比野生菌高出 100 倍以上[9][9]，产品质量与天然品从基因序列、蛋白质一级结构到蛋白质物理化学性质等方面均一致，两者具有同质性[8][8]下面，以此为例，简单叙述工程菌的构建及筛选过程[9][9]：首先从 CPU210009 菌株中提取 DNA，并用 PCR 法扩增 AnsB 基因；随后将 PCR 扩增得到的 AnsB 基因 DNA 用 Ncol 和 HindⅢ消化后，定向插入 pKK233-2 的多克隆位点而得到重组质粒；用重组质粒转化多个宿主菌，并用奈氏试剂筛选相应的阳性转化子 CTA1～5，其中以 CPU210009 作为宿主菌的转化子（CTA5）的产酶能力显著高于其他转化子在宿主菌很多的情况下，如何快速准确的筛选阳性转化子对于提高实验效率很重要，本实验中采用的奈氏试剂即奈斯勒试剂显色法，此法快速、简单，可直接从培养培养皿中筛选出产天冬酰胺酶的菌株，并且可借助比色法进行定量测定，从而直接筛选出高表达菌株[11][11]其他工程菌的构建方法基本类似，主要差异在于天冬酰胺酶基因来源和表达载体的选择上如 Priscila Lamb Wink[1][1]和 Gustavo Roth[2][2]等将胡萝卜软腐欧文(氏)菌中的天冬酰胺酶基因和 pET30a(+)表达载体构建成重组体，并用于转化多株大肠杆菌，结果表明[2][2]所有测试菌株的天冬酰胺酶表达的最适温度为 37℃，此研究对于生物反应器的放大实验过程及天冬酰胺酶的大量生产有重要意义。

再如，张志红[6][6]等通过 PCR 反应扩增大肠杆菌JM109 天冬酰胺酶基因(ansB)，将扩增片段与 pMD18-T 载体连接，构建成的重组质粒pMD18-T-asp 再与与质粒 pET-22b 进行双酶切后，进行连接重组，之后转化感受态细胞，筛选重组表达载体 pET-22b-asp利用重组表达载体 pET-22b-asp 转化 BL21(DE3)大肠杆菌，并对其发酵条件以及分离、纯化工艺进行了初步研究，结果表明工程菌成功进行了天冬酰胺酶的胞外表达并大大简化了后续分离步骤另外，科研人员还进行了一些特殊的产天冬酰胺酶工程菌的构建，如抗胰蛋白酶的天冬酰胺酶的研究表明，通过采用多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体稳定天冬酰胺酶，利用抗体有效抑制蛋白酶对天冬酰胺酶的水解作用，使其在体内稳定性大大提高，这种以抗体稳定的天冬酰胺酶可以通过融合表达实现[12][12]2 2．． 发酵条件的研究发酵条件的研究由于研究菌株的不同，其发酵条件必然存在差异，故针对发酵条件的研究进展主要从多个方面分别举例对比说明潘红春[13,14][13,14]等在对大肠杆菌天冬酰胺酶的研究过程中，发现 pH 对酶的产生有较大影响，尤其是低 pH 会强烈抑制酶的合成。

之后他们[4][4]又以E.coli1.1096 为菌株，添加无机盐的 LB 培养基作为摇瓶培养基，细致地研究了摇瓶发酵过程中 pH 因素对天冬酰胺酶产生的影响，结果表明培养基组成、缓冲体系及碳源种类均会影响 pH，从而影响酶的合成；他们还发现，控制发酵过程的适宜 pH 与通纯氧维持发酵过程的较高溶氧相结合，可明显防止菌体的过早自溶，延长菌体产酶期，大大促进天冬酰胺酶的合成除了 pH 对产酶量有影响之外，其他的影响因素还有很多，如氮源，接种量，通气量，发酵时间，搅拌器转速，摇床转数，发酵罐的高往比等等[7,15][7,15]上述因素对不同发酵菌株的影响是多样化的如陈丽媛[7][7]等以E.ColiA.S1.588 为发酵用菌株，研究确定的最佳发酵培养基（%）：玉米浆 10，牛肉膏 l，NaC1 l，pH 6.5-7.0；并确定了最佳发酵工艺参数：接菌量 1.5～2.0%，pH6.5～7.0，转数 220rpm/min，温度 37℃等而杭长标[15][15]等以常州生化千红制药有限公司产品开发部提供的大肠杆菌为发酵菌株，研究认为增加罐体高径比值，提高搅拌速度，提高发酵通气量及适当的初始 pH 值是提高天冬酰胺酶发酵的有效途径。

其他多数研究发酵影响因素的文章，也多是从这些方面进行阐述，所用菌种亦是多种多样从这些例子中我们能看出这些研究的局限性在于：研究结果只适用于特定菌株，有些仅从理论上加以阐述，缺乏具体可行的发酵方案，处于比较肤浅的水平总的说来，我认为，目前对产天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究比较局限，多在一个或少数几个菌株中进行发酵条件的研究，没有对多个有研究意义的菌株进行横向对比，缺乏普适的参考价值；如果能够对多个菌株进行同等条件下的横向发酵研究，从众多研究数据中总结出具有参考意义的参数，这才是最重要的3 3．． 天冬酰胺酶的分离纯化天冬酰胺酶的分离纯化天冬酰胺酶合成后主要分泌到周质[8,16][8,16]，当然张志红[6][6]等也成功构建了进行胞外表达天冬酰胺酶的工程菌对于分泌到周质的天冬酰胺酶，常用提取方法有冷丙酮干燥破壁（制成丙酮粉） 、蔗糖溶液提取法和反复冻融法、超声破壁法[16][16]等如刘红[17][17]等采用冷丙酮破壁处理，经稀碱液抽提、羧甲基纤维素离子交换层析和 Sepharose 亲和层析进行纯化，最后可使L-天冬酰胺酶的纯度达 94.4%，比活为 520U/mg 蛋白，总收率为 65.7%。

陈建华[8][8]等在刘景晶等研究的基础上，经蔗糖破壁、(NH4)2S04分级沉淀、透析、DEAE-DE52、Q Sepharose Fast Flow 等步骤纯化得到的天冬酰胺酶比活力高达382.9U/mg，SDS-PAGE 检测时显示为一条带，RT-HPLC 分析纯度达到 99%，最终回收率为50.5%，适合大规模的工业化生产的要求传统的提取天冬酰胺酶的方法包括制备丙酮粉和缓冲液萃取，这种方法要使用大量丙酮，产生细胞碎片，释放胞内的许多内容物，给后续纯化步骤带来困难[18,19][18,19]鉴于此，赵凤生[20][20]等用非离子表面活性剂 TritonX-100 和磷酸盐结合使用释放大肠杆菌中的天冬酰胺酶，含 2%TritonX-100 和 13%K2HPO4的水溶液可以从E.coliATCC11303 细胞中释放 70%的天冬酰胺酶；这之前和之后他还进行了多次双水相系统[18,19][18,19]释放天冬酰胺酶的研究，包括聚乙二醇-葡聚糖系统，聚乙二醇-磷酸盐系统等，这使得酶的释放和酶的纯化耦合在一个步骤完成，简化了程序，提高了效率其他学者也构建了类似的双水相系统并用于其他胞内酶或周质酶的释放，并取得了相关成果[19][19]。

对于分泌到胞外的天冬酰胺酶，其分离纯化相比于前者相对简单，如张志红[6][6]等试验表明，重组酶只须镍琼脂糖凝胶亲和层析一步纯化，而周质空间表达纯化工艺要经过破壁、离心、盐析、有机溶剂沉淀、层析等多个步骤，因此胞外表达大大简化了下游分离步骤Khushoo[21][21]等采用融合技术也实现了酶的胞外表达，即将天冬酰胺酶基因与高效先导序列pelB融合使得酶在细胞外表达，并在酶的N末端添加了6个组氨酸序列标签，然后采用Ni-NTA亲和层析法分离纯化得到天冬酰胺酶，最终回收率达到86%，每升发酵液中可以获得95mg酶尽管此法效率高，但是这种方法成本高，并不适合大规模的工业化生产[8][8]分离纯化之后还需对制得的天冬酰胺酶进行酶活力测定和相关鉴定，为进一步研究提供帮助韩俊[22][22]等采用流动注射方式，电喷雾离子化质谱法测定分子量；三氯乙酸变性，胰蛋白酶水解后，HPLC测定肽图谱；结合质谱源内碰撞诱导解离技术，解析酶解肽段的氨基酸顺序,从而实现了对酶一级结构的分析和鉴定酶活测定方面，常采用Nesseler试剂法[9,17][9,17]总的说来，目前天冬酰胺酶在大肠杆菌中的表达方式还以周质表达为主，胞外表达处于重点研究阶段，对于存在于周质的天冬酰胺酶，我认为双水相系统的应用前景很广泛，不仅因为它可以将酶的释放和纯化进行耦合从而简化程序，提高效率，还在于双水相提取条件温和，并有利于后续酶的纯化[19][19]。

ⅢⅢ问题及展望问题及展望自L-天冬酰胺酶Ⅱ应用于临床以来，白血病患者，特别是急性淋巴母细胞性白血病患者的长期无病生存率得到了明显的提高[8][8]，L-天冬酰胺酶Ⅱ的抗癌机制还应用在了其他一些肿瘤癌症的治疗，相关研究已取得了一定的成果[12][12]同时，在L-天冬酰胺酶Ⅱ结构与功能上的研究也取得了很大的进展，但是目前仍然存在不少未能解决的问题，特别是L-天冬酰胺酶Ⅱ在临床应用过程中发生的不良反应是最值得关注的问题，如进行性免疫反应、全身性过敏反应、急性胰腺炎、高血压及血液系统异常等[8][8]对于解决这些问题的研究也在不断进行中，除了之前所述的研究进展外，对天冬酰胺酶的种类繁多的化学修饰、包埋和固定化[23][23]也在解决这些问题方面做出了一定的贡献，尽管仍有影响酶活、生物相容性方面的缺陷，但是我相信随着研究的不断深入，这些问题在将来一定会得到较好的解决如基因修饰特别是基因内修饰就能很好的避免上述缺陷，在不影响酶活力的前提下，降低酶的抗原性，有望为L-天冬酰胺酶Ⅱ的研究开辟出新天地参考文献参考文献[1]Priscila Lamb Wi。