酶的分离与纯化PPT课件.ppt

第四讲 酶的分离与纯化,讲课：阳 飞 系部：生化系C-312,制作：郑穗平,第四讲 酶的分离与纯化,教学目标： 了解酶纯化方法的原理、步骤、特点以及策略 理解酶分离纯化的一般原则、酶分离和纯化方法 掌握细胞破碎的方法及酶分离纯化的方法及原理 教学重点： 细胞破碎的方法与特点、酶分离方法 教学难点： 酶分离方法特点,第四讲 酶的分离与纯化,4.1、酶的提取和分离纯化,4.2、酶的分离纯化策略,4.3、酶的分离纯化与制备过程,Go,Go,Go,4.1、酶的提取和分离纯化,细胞破碎,提取酶,酶分离纯化,,,酶浓缩,,,酶贮存,动物、植物或微生物细胞,,发酵液,,离心分离、过滤分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、结晶分离等,指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度已知绝大多数酶是蛋白质，因此用于蛋白质分离纯化的方法一般也适用于酶的分离纯化酶的分离纯化一般程序：,预处理：材料的选择、发酵液预处理、细胞破碎 粗分级分离：又称初步纯化或提取，采用适当的 方法将目的酶与其他杂蛋白分离开 细分级分离：又称高度纯化，即酶的精制 成品制作：使酶与溶剂分离。

4.2、酶的分离纯化策略,防止酶的变性失活 储存及所有操作一般在低温下（04）进行 整个过程中反应系统pH要适中（pH46） 操作中应尽量避免激烈搅拌以减少泡沫形成,1、基本原则,2、分离纯化策略,1）目的明确,2）建立一个可靠、快速的分析方法,3）纯化方法的选择,1）目的明确,酶分离纯化的最终目的就是要获得高纯度的酶，使用的目的不同，对酶的纯度要求也不同 纯度的要求必须考虑到原料的性质、终产物的预期用途和特殊的安全性问题 所有关于目标酶蛋白及关键杂质的性质的信息都有助于指导人们在纯化过程中选择分离技术和操作条件 虽然纯化的步骤越少越好，但必须保证终产物的质量应尽早除去可引起目标蛋白降解、失活或干扰分析的杂质在每个纯化步骤中都应考虑维持酶蛋白的生物活性2）建立一个可靠、快速的分析方法,快速、可靠的分析目标酶蛋白的方法 蛋白质纯度检测方法 总蛋白量检测方法 对必须清除的杂质的分析方法,3）纯化方法的选择,纯化过程不宜重复相同的步骤和条件 减少添加剂的使用 尽早去除有破坏性的杂质 尽早采用高效分离方法，将最昂贵最费时的分离方法放在最后阶段,评价纯化方法好坏标准：比活力提高倍数、总活力的回收率、重现性,酶纯度检验：电泳法、高效液相色谱法(HPLC)、化学结构分析法、 超离心沉降分析法、免疫学法、分光光度法,4.3、酶的分离纯化与制备过程,1、材料的预处理 2、细胞破碎（胞内酶） 3、酶的提取 4、酶的分离纯化方法及选择 5、酶的精制及方法 6、酶制剂的类型,1、材料的预处理,酶的来源于动物、植物的器官组织、微生物细胞发酵。

微生物细胞产酶包括胞内酶与胞外酶，两种情况都涉及将微生物细胞与发酵液进行分离 常用的分离方法主要是离心和过滤两种2、细胞破碎（胞内酶）,指采用物理、化学或生物的方法使细胞壁或细胞膜破碎，从而使得细胞内的酶得到释放 细胞破碎的方法可分为机械法和非机械法两类目前工业上最常用的是机械法JY92-II D超声波 细胞粉碎机,高压细胞破碎机,DY89-I型 电动玻璃匀浆机,细胞破碎珠,机械破碎,,捣碎法 研磨法 匀浆法,物理破碎,,温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法,化学破碎,,有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween,酶促破碎,,自溶法 外加酶制剂法,通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎,通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎,细胞破碎方法及其原理,3、酶的提取,指在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程,也称为酶的抽提 首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。

一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中；酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中 一般酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件酶的主要提取方法,讨论：提高酶分子扩散速度手段,提高温度 降低溶液粘度 增加扩散面积 缩短扩散距离 增大浓度差,？,4、酶的分离纯化方法,一、根据溶解度不同建立的纯化方法 二、按照分子大小不同建立的纯化方法 三、依据电学解离性质不同建立的纯化方法 四、利用亲和作用特性建立的纯化方法 五、利用稳定性差异建立的纯化方法,盐析法,有机溶剂沉淀法,等点沉淀法,有机聚合物沉淀法,萃取分离,凝胶过滤,膜分离,离子交换色谱,电泳,聚焦色谱,亲和色谱,亲和膜,,热变性法,酸碱变性法,表面变性法,盐析法,大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象在高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度增加而减少而沉淀而析出，这种现象称为盐析。

盐析方法：,Ks分段盐析： 在一定的温度和pH值条件下（为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法 分段盐析： 在一定的盐和离子强度的条件下（Ks为常数），通过改变温度和pH值，使不同酶或蛋白质分离的方法,,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等，其中以硫酸铵最为常用 溶解度大(25时达4.1molL) 溶解温度系数小(0为706gL，25为767gL)，即使是在低温的溶解度范围内，几乎所有的蛋白质都能盐析出来 价格便宜 浓度高时不易引起蛋白质生物活性的丧失,,在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示饱和度指溶液中饱和硫酸铵体积与溶液总体积之比 添加方法： 1）添加饱和硫酸铵溶液 2）加固体硫酸铵，固体硫酸铵的加入量可以查表,分析盐析的特点及影响因素,优点： 操作简便、安全、重现性好，适用范围广泛，同时能够达到浓缩蛋白质的目的 缺点： 分辨率差、纯度倍数低、沉淀含有大量的盐分 影响因素： pH值、温度、蛋白质浓度等,？,有机溶剂沉淀法,原理： 利用酶在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法 常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等,有机溶剂沉淀法要求：,溶剂必须能与水完全混合，不与蛋白质发生反应； 溶剂蒸气无毒且不易燃烧； 溶剂用量一般为酶液体积的2倍左右，必须预先冷却到-20左右在搅拌下缓慢加入； 沉淀析出后尽快在低温下（0以下）离心分离，用冷缓冲液溶解以降低有机溶剂的浓度； pH尽可能在靠近目标酶的等电点。

有机溶剂沉淀法的特点：,优点： 分辨率高，溶剂容易除去 缺点： 蛋白质在有机溶剂中易变性等电点沉淀法,原理： 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质具有不同的等电点，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出 在加酸或加碱调节pH值过程中，边加边搅拌并缓慢进行，以防止局部过酸或过碱而引起酶变性失活 由于在等电点时酶蛋白分子表面的水化膜仍然存在，使酶仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，一般很少单独使用有机聚合物沉淀法,原理： 在酶液中加入某些高分子物质，使其与酶形成聚合物而沉淀下来 离子型表面活性剂：十二烷基磺酸钠(SDS)； 非离子型聚合物：聚乙二醇(PEG) 聚丙烯酸：因为聚丙烯酸上带有大量的羧基，沉淀带正电的蛋白质，两者结合形成很大的颗粒而沉淀下来，加入钙离子后，聚丙烯酸形成钙盐，使蛋白质游离出来，从而使蛋白质纯化萃取分离,原理： 利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而分离双水相萃取 超临界流体萃取 反胶团萃取,双水相萃取,原理： 利用酶和杂蛋白等在不混溶的两个水相系统中分配系数的不同而达到分离目 优点： 萃取过程条件温和（两相中含有70以上的水），酶活力损失较少，处理量可大可小； 设备简单，仅需一个储罐和一个离心力不高的普通离心机； 操作方便、快捷，回收率一般可达8090。

各种双水相系统,利用PEGl500NaH2PO4体系三步双水相萃取法,回收率达96.3，纯化倍数为33,超临界流体萃取,原理： 将超临界流体作为萃取溶剂，利用分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同分离 超临界流体：指物质状态超过临界点后的流体 物理特性和传质特性通常介于液体和气体之间，黏度大大低于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于物质扩散； 扩散系数接近于气体，是通常液体的近百倍，可迅速渗透到物体的内部而溶解目标物质，快速达到萃取平衡常见超临界流体的超临界点和超临界密度,最常用超临界流体为CO2,临界点的温度为31.1，接近常温 临界压力较低，为7.38MPa 无毒、操作较安全，且液体二氧化碳的扩散系数大，可获得高的传递速率 溶剂容易从产品中分离出来,反胶团萃取,反胶团是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水基团自发地向内聚集而成的微小胶团，反胶团的形成使有机相内形成了分散的亲水微环境，使生物分子在有机相(萃取相)内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了蛋白质难溶于有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现象 表面活性剂类型：阴离子型、阳离子型、非离子型 非极性有机溶剂：环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷。

通过控制pH值、离子强度、有机溶剂的种类以及表面活性剂的种类和浓度等条件，可以改变蛋白质在两相中的分配系数，不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同使得它在两相中的分配系数不同，从而达到分离的目的 特点： 成本低、溶剂反复使用、萃取率和反萃取率高、防止酶失活,凝胶过滤（也称凝胶色谱）,原理： 利用凝胶的网状结构根据分子大小进行分离，通常以柱色谱的方式进行，柱中填充的介质是具有一定孔径的球状凝胶物质，常用于生物大分子的分离 特点： 快速、简便、不需要再生处理即可反复使用凝胶过滤介质品种：,葡聚糖系列、琼脂糖系列、聚丙烯酰胺系列、Sephacryl系列、Sephadex系列、聚乙烯醇系列、Bio-Beads SX系列等 最常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶排列组成的链状多糖等柱色谱操作：色谱介质的平衡、装柱、加样、扩展(包括洗涤和洗脱)以及与此同时进行的流出液成分(蛋白质或酶活性)的检测和收集膜分离,原理： 利用微孔超滤膜选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的 分类：,根据膜分离过程推动力本质分类： 按材料分：天然高分子材料膜、有机(合成)高分子聚合物膜、无机多孔材料膜 按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜,按膜孔径大小进行分类：,超滤技术,超滤技术是近年来依托于材料科学发展起来的先进的膜分离技术，超滤分离精度介于纳滤与微滤之间。

超滤膜通常使用的材料都是高分子聚合物，如聚砜类、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯、醋酸纤维素等 通常超滤膜所标称的截留分子质量，对具有相同分子质量的线形分子和球形蛋白质类分子，物质的截留率分别应90和95 目前常用超滤膜的截留分子质量范围在11000kDa之间工业上常用超滤膜器件,离子交换色谱,原理：利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的作用力不同而达到分离目的通常是在固定相和流动相之间发生的可逆的离子交换反应 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质，通过在不溶性高分子物质(母体) 引入可解离的基团（活性基团）而制成的，这些基团在水溶液中可与其它阳离子或阴离子起交换作用 按照离子交换剂的不同又可分为阳离子交换剂(cation exchanger)和阴离子交换剂(anion exchanger 解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂，碘酸基是强阳离子交换剂而带有弱解离基团的称为弱离子交换剂，如羧甲基是弱酸性阳离子交换剂离子交换色谱操作过程：,预处理 加样吸附 洗涤 洗脱,电。