植物组织培养技术.ppt

植物组织培养技术植物组织培养技术李兰芝生物安全科学技术学院A Glimpse of Plant Tissue Culture 主要内容：主要内容：概述概述植物组织培养含义植物组织培养含义组织培养的类型组织培养的类型植物组织培养的发展简史植物组织培养的发展简史植物组织培养在农业上的应用植物组织培养在农业上的应用本节教学目的与要求本节教学目的与要求 (1) 掌握组织培养的概念和类型；掌握组织培养的概念和类型； (2) 掌握组织培养的特点；掌握组织培养的特点； (3) 了解组织培养发展史；了解组织培养发展史； (4) 初步掌握组织培养在农业实践上的应用初步掌握组织培养在农业实践上的应用 一、什么是植物组织培养一、什么是植物组织培养What Is Tissue Culture? Or in vitro culture? Or micropropagation?（一）概念：（一）概念：器官（器官（organ)：：根、茎、叶、花、果实、种子根、茎、叶、花、果实、种子组织（组织（tissue)：：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等植物组织培养（植物组织培养（Tissue culture）） 是指用是指用无菌无菌方法使植物体的离体方法使植物体的离体（（in in vitro)vitro)器官、组织和细胞在器官、组织和细胞在人为提供的条件人为提供的条件下下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（离体培养（In vitro cultureIn vitro culture）或试管培养。

或试管培养Characteristics of Plant Tissue Culture Techniquesl①①培养条件可以人为控制培养条件可以人为控制l②②生长周期短，繁殖率高生长周期短，繁殖率高植物组织培养特点植物组织培养特点l③③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制管理方便，利于工厂化生产和自动化控制（二）植物组织培养的理论基础（二）植物组织培养的理论基础—细胞全能性细胞全能性1、细胞全能性、细胞全能性（（cell totipotency) ：植物体：植物体的每一个具有完整细胞核的细胞都具有的每一个具有完整细胞核的细胞都具有该物种全部遗传的物质，在一定条件下该物种全部遗传的物质，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力具有发育成完整植物体的潜在能力2、植物细胞全能性的表达、植物细胞全能性的表达l   脱分化（脱分化（dedifferentiation)：：将已分化的不分裂的静止细将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态一个成胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。

一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化和再分化l 再分化（再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的培养条件下可转变为各种不同的细胞类型，形成完整植株的过程脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽再再生生植植株株3、植物组织培养过程、植物组织培养过程合适的外植体合适的外植体离体的植物器离体的植物器官、组织、细官、组织、细胞胞移栽移栽 外植体（外植体（explant)：：由活体（由活体（in vivo)植物体上切取下来的，用于组织培植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料包括各种器官、组织、细胞或原生质体等养的各种接种材料包括各种器官、组织、细胞或原生质体等即能即能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段胡胡萝萝卜卜离离体体根根愈伤组织（愈伤组织（callus））在人工培养基上由外植体上形成的一团无在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。

序生长状态的薄壁细胞指经细胞与组织培养产生的可传代的指经细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞未分化细胞4、组织培养植株再生的途径、组织培养植株再生的途径魔芋胚状体魔芋胚状体1）、体细胞胚胎发生途径）、体细胞胚胎发生途径（胚状体发生途径）（胚状体发生途径） ：：           是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚叶胚5 5个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生个时期），形成具有双极性的胚状结构，而发育成再生植株的途径植株的途径胚状体发生途径胚状体发生途径外植体外植体脱脱分分化化愈伤组织愈伤组织胚状体胚状体再生植株再生植株再再分分化化2）、器官发生途径：）、器官发生途径：        由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法不定芽，再获得再生植株的方法百合鳞叶培养百合鳞叶培养外植体器官发生途径外植体器官发生途径愈伤组织愈伤组织芽分化芽分化再生苗再生苗胚状体胚状体小小麦麦愈伤组织器官发生途径愈伤组织器官发生途径外植体外植体愈伤组织愈伤组织芽芽根根再生植株再生植株脱分化脱分化再分化再分化高生长素高生长素(1,2-D)高高(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)低低(生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素)器官发生途径器官发生途径愈伤组织愈伤组织l按培养材料分为（按培养材料分为（Gamborg等等)：：愈伤组织培养愈伤组织培养器器 官官 培培 养养细细 胞胞 培培 养养原生质体培养原生质体培养最为常见的组织培养最为常见的组织培养悬浮细胞培养悬浮细胞培养单细胞培养单细胞培养胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养花和幼果的部分组织的培养（三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型l根据培养器官的不同：根据培养器官的不同： 叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养、茎尖培养等培养等烟草烟草（三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型l根据培养方式：根据培养方式：固体培养、液体培养固体培养、液体培养 固体培养固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。

培养 液体培养液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养进行震荡，又称液体震荡培养三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型固体培养固体培养液体培养液体培养l(1)固体培养法固体培养法l           是最常用的方法该方法简单，易行，但养是最常用的方法该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生l(2)液体培养法液体培养法l             由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的由于液体中氧气含量较少，常用振动培养的方法以确保氧气的供给方法以确保氧气的供给l 往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为般为50-200r50-200r／／minmin，这种定期浸没的方法，既能使，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给培养基均一，又能保证氧气的供给 固体培养、液体培养的特点：固体培养、液体培养的特点：l根据培养物量的多少：根据培养物量的多少： 大量培养、微量培养大量培养、微量培养。

l根据培养过程中是否需光：根据培养过程中是否需光： 光培养、暗培养光培养、暗培养l根据培养方法的不同：根据培养方法的不同： 平板培养、微室培养、悬浮培养等平板培养、微室培养、悬浮培养等（三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型l按培养过程分为按培养过程分为:初代培养和继代培养初代培养和继代培养初代培养（初代培养（Primary culture）：）： 指外植体的最初培养指外植体的最初培养继代培养（继代培养（Subculture）：）： 将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养种反复多次移植的培养，称为继代培养三）、植物组织培养的类型（三）、植物组织培养的类型二、植物组织培养发展简史二、植物组织培养发展简史1 1、、萌芽阶段萌芽阶段：：( (从从2020世纪初到世纪初到3030年代中）年代中）Ø 1838-18391838-1839年，德国科学家年，德国科学家SchleideSchleide 和和SchwannSchwann发表了细胞学发表了细胞学说，奠定了组织培养的理论基础。

说，奠定了组织培养的理论基础Ø19021902年，德国植物学家年，德国植物学家HaberlandtHaberlandt 根据细胞学说，提出植物根据细胞学说，提出植物细胞全能性（细胞全能性（totipotencytotipotency））理论Ø19041904年，年，HanningHanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚Ø19221922年，年，Knudson Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗采用胚培养法获得大量兰花幼苗克服其种克服其种子发芽困难的问题子发芽困难的问题Ø1925年：年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种玉米成熟胚的培养玉米成熟胚的培养Haberlandt：：观点：观点：贡献：贡献：提出细胞全能性提出细胞全能性首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞以分割成单个细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞无分裂无分裂细胞高度分化细胞高度分化+培养基中无生长激素培养基中无生长激素Knop+蔗糖蔗糖19341934年，美国植物生理学家年，美国植物生理学家White White 用番茄根尖建立起第一个活跃用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。

生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功2 2、、奠基阶段奠基阶段（从（从2020世纪世纪3030年代末到年代末到5050年代中）年代中）1934年：年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了Callus1937年：年：White发现发现3种种B族维生素和族维生素和IAA对植物生长有用对植物生长有用1939年：年：Gautherete培养胡萝卜根小外植体成功培养胡萝卜根小外植体成功1939年：年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功培养烟草种间杂种幼茎切段原形成层成功1939年：年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功组织培养的奠基人组织培养的奠基人3、、快速发展和应用阶段快速发展和应用阶段（从（从20世纪世纪50年代末至今）年代末至今）l 19581958年，英国科学家年，英国科学家Steward Steward 等用胡萝卜根的愈伤组织等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株这是第一次实现人工体细胞胚，是植物组织培养的第一第一次实现人工体细胞胚，是植物组织培养的第一个突破。

个突破l 19601960年英国学者年英国学者CockingCocking用酶法分离原生质体成功这是用酶法分离原生质体成功这是植植物组织培养的第二个突破物组织培养的第二个突破l 19621962年，年，MurashingeMurashinge 和和SkoogSkoog 在烟草培养中筛选出至今仍在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的被广泛使用的MSMS培养基培养基l 1964-19661964-1966年，印度科学家年，印度科学家GuhaGuha 和和MaheswariMaheswari 在曼陀罗花在曼陀罗花药培养中药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株首次由花粉诱导得到了单倍体植株l19721972年，年，Carlson Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了得了第一个体细胞杂交的杂种植株第一个体细胞杂交的杂种植株……三、应用领域三、应用领域1、快速繁殖、快速繁殖2、种苗脱毒、种苗脱毒3、远缘杂交、远缘杂交8、、植物性药物和生物制品的生产植物性药物和生物制品的生产7、基因工程、基因工程 　　6、种质保存、种质保存4、突变育种、突变育种5、单倍体育种、单倍体育种四、植物组织培养在技术上的发展四、植物组织培养在技术上的发展q研究材料范围逐步扩大研究材料范围逐步扩大q培养方法逐步完善培养方法逐步完善q培养基不断改进培养基不断改进q实验手段逐步完备实验手段逐步完备植物再生植株的途径植物再生植株的途径小结：小结：Ø (1)植物组织培养植物组织培养是指分离单个或多个细胞或植物体的一部是指分离单个或多个细胞或植物体的一部分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整分，在人工配制的培养基上进行培养，使之长成一株完整植物体的过程。

植物体的过程Ø(2)类型：类型：按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、按照外植体的不同，分为植株培养、胚胎培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型Ø (3)组织培养特点组织培养特点：培养条件可以人为控制；生长周期短，：培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而繁殖率高；管理方便，利于工厂化生产的突出特点，因而发展迅速发展迅速Ø (4)组织培养技术在农业生产上的应用组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗厂化育苗植物组织培养实验室 构建及操作技术植物组织培养学植物组织培养学本节教学目的与要求：l(1)掌握组织培养实验室的设计；掌握组织培养实验室的设计；l(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；方法；l(3)掌握调控组织培养的主要环境条件掌握调控组织培养的主要环境条件l(4)掌握灭菌和消毒的区别；掌握灭菌和消毒的区别；l(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；p 商业性组织培养实验室和小工厂的商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备设计与主要设备p 培养基及其配制培养基及其配制p 外植体的选择与培养外植体的选择与培养p 试管苗的驯化与移栽试管苗的驯化与移栽 本节主要内容本节主要内容 1 1、培养器皿的清洗；、培养器皿的清洗； 2 2、培养基的配制、分装和高压灭菌；、培养基的配制、分装和高压灭菌； 3 3、无菌操作、无菌操作————材料的表面灭菌和接种；材料的表面灭菌和接种； 4 4、将培养物放到培养室培养；、将培养物放到培养室培养； 5 5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。

试管苗的驯化、移栽和初期管理一 商业性组织培养实验室和小工厂的 设计与主要设备一般组织培养的操作工序：一般组织培养的操作工序：准备室准备室准备室准备室温室温室温室温室驯化室驯化室驯化室驯化室培养室培养室培养室培养室无菌操作室无菌操作室无菌操作室无菌操作室缓冲室缓冲室缓冲室缓冲室实验室组成实验室组成实验室组成实验室组成一、设计：一、设计：二、仪器设备和器皿用具1、超净工作台或接种箱、超净工作台或接种箱2、空调、空调3、除湿机或加湿器、除湿机或加湿器4、恒温培养箱、恒温培养箱5、高压灭菌锅、高压灭菌锅6、冰箱、冰箱7、天平、天平8、显微镜、显微镜9、水浴锅、水浴锅10、摇床与转床、摇床与转床11、蒸馏水发生器、蒸馏水发生器12、酸度计、酸度计13、离心机、离心机（（一一））常常见见仪仪器器设设备备组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、 圆形培养瓶、果酱瓶2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、 试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。

组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备（二）各类玻璃器皿1 1、镊子：尖头镊子、枪形镊子、镊子：尖头镊子、枪形镊子2 2、剪子、剪子3 3、解剖刀、解剖刀4 4、接种针、接种针5 5、钻孔器、钻孔器组织培养实验室的组织培养实验室的 设计与主要设备设计与主要设备（三）器械用具二 培养基及其配制本节目的要求：本节目的要求：(1)(1)一般掌握培养基的种类、特点；一般掌握培养基的种类、特点；(2)(2)掌握基本培养基的配方；掌握基本培养基的配方；(3)(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；(5)(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)(6)一般掌握培养基的筛选办法一般掌握培养基的筛选办法 一、培养基的成分培养基及其配制培养基及其配制其它添加物其它添加物其它添加物其它添加物碳水化合物碳水化合物碳水化合物碳水化合物植物生长调节剂植物生长调节剂植物生长调节剂植物生长调节剂有机营养物有机营养物有机营养物有机营养物无机营养物无机营养物无机营养物无机营养物培养基组成培养基组成1、无机营养元素(inorganic element) 1)1)大量元素：大量元素：指浓度大于指浓度大于0.5mmol0.5mmol／／L L的元素。

的元素 [N[N、、P P、、K K、、MgMg、、S S和和CaCa等等] ]2)2)微量元素：微量元素：指小于指小于0.5mmol0.5mmol／／L L的元素 [Fe[Fe，，B B，，MnMn，，CuCu，，MoMo，，CoCo等等] ] 培养基及其配制培养基及其配制2、有机化合物(organic compound) F最最常常用用的的碳碳源源是是蔗蔗糖糖，，葡葡萄萄糖糖和和果果糖糖也也是是较较好好的的碳碳源F  使用浓度在使用浓度在1%—5%，常用，常用3%F   作用：碳源；维持培养基渗透压作用：碳源；维持培养基渗透压 （（（（1 1）碳水化合物）碳水化合物）碳水化合物）碳水化合物培养基及其配制培养基及其配制l在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动l种类：种类：VBl(盐酸硫胺素盐酸硫胺素)、、               VB6(盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇)、、               Vpp(烟酸烟酸)、、               Vc（（抗坏血酸）、抗坏血酸）、               VH(生物素生物素)、、               VB11(叶酸叶酸)、、               VB12（（钴胺素钴胺素)等。

等l使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.1—1.0mg／／L2）维生素）维生素(vitamin) 培养基及其配制培养基及其配制l又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用l使用浓度使用浓度：一般：一般为为lOOmglOOmg／／L L，，l作用作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成对组织和细胞的长以及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用有作用 （（3）肌醇）肌醇   培养基及其配制培养基及其配制l作用作用：是很好的有机氮源，可直接被细：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用胞吸收利用l种类种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等冬酰胺、丙氨酸等l使用浓度使用浓度：为：为10—200mg10—200mg／／L L4）氨基酸）氨基酸 (almino acide））培养基及其配制培养基及其配制3、有机附加物 （天然复合物）10%—20%10%—20%150-200ml150-200ml／／／／L L150—200g150—200g／／／／L L0.01%-0.05%0.01%-0.05%浓度：浓度：浓度：浓度：培养基及其配制培养基及其配制有机附加物有机附加物有机附加物有机附加物椰乳椰乳香蕉香蕉马铃薯马铃薯酵母提取液酵母提取液4、植物生长调节物质(hormone) l赤霉素（赤霉素（gibberellic acid））l细胞分裂素类细胞分裂素类 ( cytokinin )l生长素类生长素类(auxin)培养基及其配制培养基及其配制 * *作作用用：：主主要要被被用用于于诱诱导导愈愈伤伤组组织织形形成成；；促促进进细细胞胞脱脱分分化化；；促促进进细细胞胞伸伸长长；；促促进进生生根。

根 在在促促进进生生长长方方面面，，根根对对生生长长素素最最敏敏感感在在极极低低的的浓浓度度下下，，(10(10-5-5—10—10-8-8mgmg／／L)L)就就可可促进生长，其次是茎和芽促进生长，其次是茎和芽1）生长素类）生长素类   培养基及其配制培养基及其配制Ø吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAA（（indo acetic acid））Ø萘萘 乙乙 酸酸 ：： NAA（（ naphthalene  acetic acid））Ø吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBA（（indolebutyri acid））Ø2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4—D                 (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) *生长素种类：生长素种类：培养基及其配制培养基及其配制IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)生长素作用强弱顺序：强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制种类：种类：l6—BA(6—苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)lKt (kinetin 激动素激动素)lZt (zeatin 玉米素玉米素)（（（（2 2）细胞分裂素类）细胞分裂素类）细胞分裂素类）细胞分裂素类 细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：①①①①促进细胞分裂与扩大。

促进细胞分裂与扩大促进细胞分裂与扩大促进细胞分裂与扩大②②②②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长   ③③③③抑制根的分化抑制根的分化抑制根的分化抑制根的分化培养基及其配制培养基及其配制Kt ( 激动素激动素)6—BA(6—苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt (玉米素玉米素)细胞分裂素作用强弱顺序强强弱弱培养基及其配制培养基及其配制GAGA3 3（（赤霉酸）：赤霉酸）：作作用用：：促促进进幼幼芽芽伸伸长长生生长长，，促促进进不不定定胚胚发发育育成小植株成小植株 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当分化有影响：当生长素／赤霉素比值高生长素／赤霉素比值高时时有利于有利于木质部木质部分化，分化，比值低比值低时有利于时有利于韧皮韧皮部部分化3 3）赤霉素）赤霉素）赤霉素）赤霉素培养基及其配制培养基及其配制5、培养材料的支持物 ---琼脂(agar) l固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂。

l用量：用量：6—10g6—10g／／L Ll琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至成为溶胶，冷却至40 ℃40 ℃即凝固为固体状凝胶即凝固为固体状凝胶l琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与外，还与高压灭菌时的温度、时间、高压灭菌时的温度、时间、pHpH值值等因素等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力 培养基及其配制培养基及其配制固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点优点: :操作简便，通气问题易解决，便于观察研究操作简便，通气问题易解决，便于观察研究缺点缺点: :培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触( (即吸收即吸收) )面积小，各种面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。

组织产生毒害作用固体培养固体培养液体培养液体培养培养基及其配制培养基及其配制6、抗生物质(antibiotic) l种类：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等青霉素、链霉素、庆大霉素等l浓度：浓度：5—20mg/Ll作用：作用：可可防止菌类污染防止菌类污染培养基及其配制培养基及其配制7、活性炭(active carbon) l目的：目的：是是利用其吸附能力，减少一些有毒利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响物质的影响；利于生根利于生根l使用浓度：使用浓度：1—5g／／Ll它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附吸附力减弱，甚至不吸附培养基及其配制培养基及其配制8、水（water)作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒一切代谢过程的介质和溶媒 注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性大规模生产时持培养基成分的精确性大规模生产时可用自来水可用自来水培养基及其配制培养基及其配制二、培养基的PH值 (pH value)1、多数植物要求、多数植物要求pH5.6-5.82、用、用0.1-1N的的NaOH和和0.1-1N的的HCI调节调节. .3、、注意：注意：p经高压灭菌后，培养基经高压灭菌后，培养基pHpH会下降会下降0.2-0.2-0.8,0.8,固调整固调整pHpH值时值时, ,应高于应高于0.50.5；；ppHpH的大小会影响琼脂的凝固能力，当的大小会影响琼脂的凝固能力，当pHpH>6.0>6.0时，培养基将会变时，培养基将会变硬，硬，pH <5.0pH <5.0时，时，琼脂凝固不好。

琼脂凝固不好培养基及其配制培养基及其配制种种类最适最适pH值种种类最适最适pH值杜杜鹃4.0月季月季5.8越桔越桔4.5胡胡萝卜、石刁柏卜、石刁柏6.0蚕豆蚕豆5.5桃桃7.0番茄番茄5.7  培养基及其配制培养基及其配制不同植物对培养基最适不同植物对培养基最适pH值的要求不同值的要求不同(见表见表)         培养基培养基(culture medium) ：：是植物组织培是植物组织培养的重要基质在离体培养条件下，不同种植养的重要基质在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同因物不同部位的组织对营养的要求也不相同因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功功 三、培养基的种类、配方及特点培养基及其配制培养基及其配制1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、 生根培养基生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、 改良培养基。

改良培养基一）培养基的种类（一）培养基的种类（一）培养基的种类（一）培养基的种类培养基及其配制培养基及其配制F 若只含有大量元素与微量元素和碳水化若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为合物的培养基，称为基本培养基基本培养基F 在基本培养基的基础上，添加各种各样在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的的生长调节物质和其他有机附加物的培养培养基基叫叫完全培养基完全培养基初代培养基： 指用来第一次接种外植体的培养基继代培养基：指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基 培养基及其配制培养基及其配制母液名称母液名称 药品品 名称名称   原配方量原配方量 (mg)/ L大量元素母大量元素母液液  NH4NO31650KNO31900CaCl·2H2O440MgSO4 ·7H2O370KH2PO4170微量元素母微量元素母液液 MnSO4·H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6CoCl·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.02H3BO36.2Na2MO4·2H2O0.25KI0.83铁盐母液母液 FeSO4·7H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp)0.5盐酸吡哆醇酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺素酸硫胺素 0.1肌醇肌醇 100甘氨酸甘氨酸 2（（二二）） MS培培养养基基配配方方培养基及其配制培养基及其配制1 1、、 MSMS培培 养养 基基 ：： 它它 是是 19621962年年 由由 MurashigeMurashige和和SkoogSkoog为为培培养养烟烟草草细细胞胞而而设设计计的的。

是是目目前前应应用最广泛的培养基用最广泛的培养基 特特点点：：是是无无机机盐盐离离子子浓浓度度较较高高，，有有高高含含量量的的N N、、K K，，硝酸盐量大，营养丰富硝酸盐量大，营养丰富三）常用的培养基及特点（三）常用的培养基及特点培养基及其配制培养基及其配制2 2、、WhiteWhite培培养养基基：：19431943年年由由WhiteWhite为为培培养养番番茄根尖而设计的茄根尖而设计的特点：特点：无机盐浓度较低，适于生根培养无机盐浓度较低，适于生根培养3 3 3 3、、、、N6N6N6N6培养基：培养基：培养基：培养基：1974197419741974年朱至清等为水稻等禾谷类作年朱至清等为水稻等禾谷类作年朱至清等为水稻等禾谷类作年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的物花药培养而设计的物花药培养而设计的物花药培养而设计的特点：特点：特点：特点：是成分较简单，是成分较简单，是成分较简单，是成分较简单，KNO3KNO3KNO3KNO3和（和（和（和（NH4NH4NH4NH4））））2SO42SO42SO42SO4含量高，含量高，含量高，含量高，不含钼在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他不含钼。

在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他不含钼在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他不含钼在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养植物的花粉和花药培养植物的花粉和花药培养植物的花粉和花药培养培养基及其配制培养基及其配制(4)B(4)B5 5培培养养基基: :是是19681968年年由由GalmborgGalmborg等等为为培培养养大豆根细胞而设计的大豆根细胞而设计的特特点点：：是是含含有有较较低低的的铵铵盐盐，，较较高高的的硝硝酸酸盐盐和和盐酸硫胺素盐酸硫胺素5)KM—8P(5)KM—8P培养基培养基: :它是它是19741974年为原生质体培年为原生质体培养而设计的养而设计的特点：特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素单糖和维生素培养基及其配制培养基及其配制 四、 培养基的配制 （一）、母液（一）、母液(stock solution)的配制和保存的配制和保存l所谓所谓母液母液是欲配制液的是欲配制液的浓缩液浓缩液l意义意义:   ①①保证各物质成分的准确性保证各物质成分的准确性 ② ②配制时的快速移取配制时的快速移取 ③ ③便于低温保藏。

便于低温保藏l一般母液配成比所需浓度一般母液配成比所需浓度高高10-10010-100倍l母液配制时可分别配成母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等铁盐、有机物和激素类等培养基及其配制培养基及其配制单配法：单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液一般用一定浓度的母液一般用mg/ml mg/ml 或或mg/Lmg/L表示l混配法：混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液l配制生长素类：配制生长素类：可先用少量可先用少量0.1N0.1N的的NaOHNaOH或或95%95%酒酒精助溶精助溶浓度为：浓度为：1-5mg1-5mg／／mlmll配制细胞分裂素类：配制细胞分裂素类：一般先用少量一般先用少量0.5-1N0.5-1N盐酸盐酸加热溶解加热溶解浓度为：浓度为：1-5mg1-5mg／／mlml培养基及其配制培养基及其配制 母液的配制方法：母液的配制方法： ＭＳ培养基母液的配制 母液名称母液名称 药品品 名称名称   原配方量原配方量 (mg)/ L扩大倍数大倍数   称取量称取量   (mg) 母液体母液体积      (ml)   移取量移取量   (ml)/L 大量元素母液大量元素母液  NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl·2H2O44010 4400MgSO4 ·7H2O370103700KH2PO417010 1700微量元素母液微量元素母液 MnSO4·H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860CoCl·6H2O0.0251002.5CuSO4·5H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MO4·2H2O0.25100 25KI0.83100 83铁盐母液母液 FeSO4·7H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp)0.5502550010盐酸吡哆醇酸吡哆醇 0.55025盐酸硫胺素酸硫胺素 0.1505肌醇肌醇 100505000甘氨酸甘氨酸 250100培养基及其配制培养基及其配制（二）培养基的配制及其灭菌l1.配制方法：配制方法：1 1、、将母液按顺序摆放将母液按顺序摆放2 2、取适量的蒸馏水、取适量的蒸馏水( (所需培养基量的所需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器3 3、按需要量依次取母液及生长调节物质、按需要量依次取母液及生长调节物质4 4、加入蔗糖、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解5 5、加琼脂、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，，煮沸，煮沸，2-3min2-3min5 5、、定容定容6 6、调、调PHPH值值(pH=5.8)(pH=5.8)7 7、、分装培养瓶，封口分装培养瓶，封口8 8、高压灭菌、高压灭菌培养基及其配制培养基及其配制l组织培养常见的灭菌方法组织培养常见的灭菌方法l消毒消毒:是指杀死、消除或充分抑制部分微是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。

生物，使之不再发生危害作用l灭菌灭菌:是指用物理或化学的方法，杀死物是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死即把所有生命的物质全部杀死培养基及其配制培养基及其配制常用的灭菌方法常用的灭菌方法物理方法物理方法化学方法化学方法干热灭菌干热灭菌(烘烧和灼烧烘烧和灼烧)湿热灭菌湿热灭菌(常压或高压蒸煮常压或高压蒸煮)射线处理射线处理(紫外线、超声波、微波紫外线、超声波、微波)过滤除菌过滤除菌大量无菌水冲洗大量无菌水冲洗升汞升汞(氯化汞氯化汞)甲醛甲醛(福尔马林福尔马林)过氧化氢过氧化氢高锰酸钾高锰酸钾来苏儿来苏儿漂白粉漂白粉次氯酸钠次氯酸钠酒精酒精培养基及其配制培养基及其配制2.培养基的灭菌－湿热灭菌法l培养基在制备后的培养基在制备后的24h内完成灭菌工序内完成灭菌工序l高压灭菌的原理：高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在高，从而锅内温度也随之增加。

在108kPa108kPa的压力的压力下，锅内下，锅内温度达温度达121℃121℃在此蒸气在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢耐热的芽孢培养基及其配制培养基及其配制将锅内将锅内空气完全排除后，关闭空气完全排除后，关闭放气阀当压力表上升达当压力表上升达108kPa108kPa时，锅内温度达时，锅内温度达121℃121℃（在此蒸气温度下，可（在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢），维持耐热的芽孢），维持20-30min20-30min培养基及其配制培养基及其配制灭菌方法：灭菌方法：过滤灭(除)菌（不耐热的物质 ）l一些生长调节剂一些生长调节剂( (赤霉素、玉米赤霉素、玉米素素) )、某些维生素是不耐热的，、某些维生素是不耐热的，常用常用过滤灭菌过滤灭菌- -细菌过滤器细菌过滤器方法l防细菌滤膜网孔的直径为防细菌滤膜网孔的直径为0.45μm0.45μm以下，可阻止细菌细胞以下，可阻止细菌细胞和真菌的孢子通过和真菌的孢子通过培养基及其配制培养基及其配制空间及物体表面灭菌培养基及其配制培养基及其配制l熏蒸剂熏蒸剂: :甲醛甲醛和和高锰酸钾高锰酸钾。

1)紫外线灭菌紫外线灭菌(2)熏蒸灭菌熏蒸灭菌2.培养基的灭菌－湿热灭菌法l培养基在制备后的培养基在制备后的24h内完成灭菌工序内完成灭菌工序l高压灭菌的原理：高压灭菌的原理： 在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加在高，从而锅内温度也随之增加在108kPa108kPa的压力的压力下，锅内下，锅内温度达温度达121℃121℃在此蒸气在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢耐热的芽孢培养基及其配制培养基及其配制 第四节第四节 植物抗病细胞植物抗病细胞突变体筛选突变体筛选p抗病细胞突变体基本原理抗病细胞突变体基本原理p抗病细胞突变体筛选程序抗病细胞突变体筛选程序p抗病细胞突变体筛选实例抗病细胞突变体筛选实例本节主要内容本节主要内容基本原理基本原理植物抗病细胞突变体筛选l利用植物组织培养过程中出现的变利用植物组织培养过程中出现的变异，或由物理、化学因素诱发变异，异，或由物理、化学因素诱发变异，给予一定的选择压力，筛选出符合给予一定的选择压力，筛选出符合育种目标的无性系。

育种目标的无性系基本程序基本程序植物抗病细胞突变体筛选选择压力选择压力选选择择突突变变体体分分离离突突变变体体鉴鉴定定突突变变体体愈伤组织愈伤组织细胞细胞原生质体原生质体保保持持和和利利用用突突变变体体l愈伤组织：愈伤组织：最简单最简单的细胞材料，缺点多，的细胞材料，缺点多，普遍普遍采用采用l细胞培养物：细胞培养物： 由少数细胞集合而成，可弥补愈由少数细胞集合而成，可弥补愈伤组织的不足伤组织的不足l原生质体：原生质体：最理想最理想的细胞材料，但分离和培养的细胞材料，但分离和培养技术不完善，不能普遍采用技术不完善，不能普遍采用植物抗病细胞突变体筛选 材料选择材料选择l负选择法：负选择法：选择一种培养基，使得突变细胞不选择一种培养基，使得突变细胞不能生长，野生型细胞生长然后加负选择剂，能生长，野生型细胞生长然后加负选择剂，可杀死生长分裂细胞，保留不能生长的突变细可杀死生长分裂细胞，保留不能生长的突变细胞l正选择法：正选择法： 将细胞置于有害或有毒的培养基中，将细胞置于有害或有毒的培养基中，能生长的为突变细胞能生长的为突变细胞植物抗病细胞突变体筛选突变体的分离突变体的分离l突变体的突变体的4 4个特征：个特征：l 突变体以低频率发生突变体以低频率发生l 离开选择压，突变体稳定离开选择压，突变体稳定l 植株再生后，突变细胞系稳定，从再生植株发植株再生后，突变细胞系稳定，从再生植株发生的愈伤组织，表达其被选择出的表现型生的愈伤组织，表达其被选择出的表现型l 选择出的表现型能通过有性传递保证它是突变选择出的表现型能通过有性传递保证它是突变的。

的植物抗病细胞突变体筛选突变体的鉴定突变体的鉴定l 储藏再生植株种子储藏再生植株种子l 突变细胞系再生成植株，取其茎尖无菌无性系突变细胞系再生成植株，取其茎尖无菌无性系l 不能再生植株细胞系与液氮中低温储藏不能再生植株细胞系与液氮中低温储藏植物抗病细胞突变体筛选突变体的保存突变体的保存抗病虫细胞工程育种抗病虫细胞工程育种 (1) 概念和类型；概念和类型； (2) 抗病虫花培单倍体育种；抗病虫花培单倍体育种； (3) 抗病虫体细胞杂交育种；抗病虫体细胞杂交育种；（一）概念：（一）概念：无性系变异离体筛选无性系变异离体筛选 花药或花粉离体培养花药或花粉离体培养抗病虫细胞工程育种 是指用细胞工程技术有目的地改造植物的是指用细胞工程技术有目的地改造植物的抗性，以获得抗病虫的新品种或新物种抗性，以获得抗病虫的新品种或新物种三条途径：三条途径：抗病虫细胞工程育种体细胞杂交引入抗病虫性状体细胞杂交引入抗病虫性状l定义：指通过花药或花粉离体培养再生单倍体定义：指通过花药或花粉离体培养再生单倍体植株，然后经过染色体加倍和常规选育获得抗植株，然后经过染色体加倍和常规选育获得抗病虫植物品种的育种方法。

病虫植物品种的育种方法抗病虫细胞工程育种抗病虫花培单倍体育种抗病虫花培单倍体育种育种程序育种程序1. 选择亲本进行有性杂交选择亲本进行有性杂交2. 取杂交后代的取杂交后代的花药或花粉培养花药或花粉培养，获得各种类型的，获得各种类型的单倍体植株单倍体植株3. 染色体加倍，得到纯合二倍体株系染色体加倍，得到纯合二倍体株系4. 鉴定抗病虫的优良品系鉴定抗病虫的优良品系5. 通过区试和品种审定，得到抗病虫的优良品种通过区试和品种审定，得到抗病虫的优良品种抗病虫细胞工程育种l①①外植体的选择与预处理外植体的选择与预处理l②②材料的表面消毒材料的表面消毒花药培养的一般步骤花药培养的一般步骤l③③接种和预培养接种和预培养l④④培养与植株再生培养与植株再生l⑤⑤生根壮苗与移栽生根壮苗与移栽花蕾或幼穗，保湿，花蕾或幼穗，保湿，低温处理低温处理预培养可提高预培养可提高花粉植株的诱导率花粉植株的诱导率花粉植株倍性鉴定与染色体加倍花粉植株倍性鉴定与染色体加倍l倍性鉴定：取花粉植株的茎尖或根尖组织，倍性鉴定：取花粉植株的茎尖或根尖组织，制成临时装片，在显微镜下对细胞进行染制成临时装片，在显微镜下对细胞进行染色体计数。

色体计数l加倍：加倍：0.02%~0.4%秋水仙碱处理秋水仙碱处理抗病虫细胞工程育种l定义：利用植物体细胞杂交技术并结合常规育定义：利用植物体细胞杂交技术并结合常规育种培育出抗病虫品种的育种方法种培育出抗病虫品种的育种方法l植物体细胞杂交：指将植物不同种、属或科间植物体细胞杂交：指将植物不同种、属或科间的体细胞原生质体通过人工方法诱导融合形成的体细胞原生质体通过人工方法诱导融合形成杂种细胞，然后进行离体培养使其再生成植株杂种细胞，然后进行离体培养使其再生成植株的技术抗病虫细胞工程育种抗病虫体细胞杂交育种抗病虫体细胞杂交育种育种程序育种程序1. 选择亲本进行体细胞杂交选择亲本进行体细胞杂交2. 原生质体的制备原生质体的制备3. 原生质体融合原生质体融合4. 杂种细胞的筛选与鉴定杂种细胞的筛选与鉴定5. 杂种细胞的培养与植株再生杂种细胞的培养与植株再生抗病虫细胞工程育种5.结合常规育种培育出抗病虫品种结合常规育种培育出抗病虫品种。