当前人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察-外科学论文.doc

当前人子宫内膜异位症在位和异位内膜细胞原代培养及形态学观察-_外科学论文 作者摘要：俞超芹，石书芳，刘玉环，王瑞霞，宋艳华，俞瑾 【 子宫内膜异位症 ［摘要］ 目的摘要：探索子宫内膜异位症（endometriosis, EM）异位子宫内膜细胞原代培养方法，并比较EM在位及异位子宫内膜细胞和正常对照在位子宫内膜细胞形态的差异方法摘要：采用改良EM细胞原代培养方法，免疫细胞化学法鉴定细胞类型，在光学显微镜及电子显微镜下观察细胞形态差异结果摘要：正常对照子宫内膜细胞及EM在位、异位子宫内膜细胞分离培养成功率分别为91.67%、93.75%和75.00%EM异位、在位子宫内膜腺上皮细胞和正常在位子宫内膜腺上皮细胞大小相似，但EM异位子宫内膜腺上皮细胞染色质增多，核增大EM异位子宫内膜间质细胞较EM在位及正常在位子宫内膜间质细胞小，且细胞膜表面有较多的微绒毛和胞浆突起结论摘要：注重取材方式，采用改良原代培养方法，可以进步EM异位子宫内膜细胞培养成功率EM异位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞超微结构和正常妇女及EM在位子宫内膜细胞有明显不同　　［］ 子宫内膜异位症; 原代培养; 腺上皮细胞; 间质细胞　　Primary culture and morphologic observation of eutopic and ectopic endometrial cells from patients with endomehiosis　　ABSTRACT Objective摘要: To explore the method of primary culture for endometriotic cells and to find out the differences in morphological manifestations among endometriotic cells and eutopic endometrial cells sampled from patients with endometriosis and endometriosisfree women. Methods摘要: Endometriotic and eutopic endometrial cells were cultured by modified method of primary culture. The endometriotic cell types were observed and differentiated under optical and electron microscopes. Results摘要: The success rates for culture of eutopic endometrial cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis were 91.67% and 93.75% respectively. The success rate for culture of endometriotic cells was 75.00%. The size of endometriotic glandular cells was similar to those of eutopic endometrial glandular cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis. The chromatin was manifold and the nucleus was augmented in the endometriotic glandular cells. The endometriotic stromal cells were smaller than the eutopic endometrial stromal cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis. Many tiny villi and protuberances on plasma membrane could be seen in the endometriotic stromal cells. Conclusion摘要: The success rate for culture of endometriotic cells can be elevated through improving the method of primary culture. The ultrastructures of endometriotic glandular and stromal cells are obviously different from those of eutopic endometrial glandular and stromal cells from endometriosisfree women and patients with endometriosis.　　KEY WORDS endometriosis; primary culture; glandular cells; stromal cells　　子宫内膜异位症（endometriosis, EM）是子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞种植于子宫腔以外的雌激素依靠性疾病，具有侵袭性生长、广泛种植、易复发等恶性肿瘤样特性。

固然EM的发现已有一百多年的历史，但其病因尚不十分清楚，亦无有效的治疗方法因此，EM是目前妇科学界探究的热门之一已有的大量探究表明，异位子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞的功能及相互功能不同于在位内膜［1,2］，而原代培养细胞由于刚离开机体，因此能较好地反映体内细胞的生物学特性，故原代培养已成为EM体外探究的一个重要方法实践表明，在位和异位内膜间质细胞及腺上皮细胞的分离培养成功率并不高，尤其是异位内膜细胞培养的成功率较低，故本探究对EM在位内膜细胞及异位内膜细胞的分离培养方法进行了探索，观察正常子宫内膜细胞、EM在位内膜细胞及EM异位内膜细胞之间形态学的差异，从细胞形态学角度探究EM的发病机制，以期为EM的探究提供有价值的体外细胞模型　　1 材料和方法　　1.1 材料　　1.1.1 标本采集 （1）2002年12月～2003年7月在长海医院妇产科行手术治疗的EM患者共16例，年龄23～47岁，均匀（41.13±2.78）岁；所有患者均无内科合并症，月经规律；术前3个月内未服用激素类药物；剖腹行全子宫切除术或子宫附件切除术后，分离子宫内膜、巧克力囊肿内皮及盆腔异位灶2）因子宫肌瘤行全子宫切除术患者共12例，年龄23～47岁，均匀（41.83±2.79）岁；无内科合并症；术前3个月内未服用激素类药物；剖腹行子宫附件切除术后刮取子宫内膜。

　　1.1.2 主要仪器 CO2细胞培养箱（德国Hereaus公司产品）；SWCJ2F型净化工作台（江苏苏州安乐空气技术有限公司产品；微量可调移液器（法国Glison公司产品）；颠倒相差显微镜（上海光学仪器厂产品）；KA1000台式离心机和SH288型37 ℃恒温水浴摇床（上海安亭科技仪器厂产品）　　1.1.3 主要试剂 F12培养基、达氏改良依氏培养基（Dulbecoo’s modified Eagle’s Medium, DMEM）、谷氨酰胺（美国Gibco公司产品）；Ⅳ型胶原酶、牛血清白蛋白、胎牛血清（美国Sigma公司产品）；DNaseⅠ酶（华美生物工程有限公司产品）；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品）；鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体（美国Santa公司产品）；链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶连接法（streptavidinbiotin peroxidase, SP）免疫组织化学试剂盒（美国DOKA公司产品）　　1.2 实验方法 将组织标本用无菌F12/DMEM（FD）培养液冲洗后，按文献方法［3,4］经不断实践后改良进行分离培养操纵具体实验步骤如下摘要：将子宫内膜标本用无菌生理盐水冲洗后，放进冰浴的FD培养液中。

用FD清洗后剪碎标本，加进FD培养液，再加进Ⅳ型胶原酶（终浓度为1 mg/ml），37 ℃恒温水浴摇床中消化60 min后，加进DNaseⅠ（终浓度为15 U/ml），继续消化30 min将消化后的组织吸进离心管中，700 r/min离心7 min，弃上清液，加进含10%胎牛血清的FD培养液，700 r/min，离心7 min，弃上清液加进FD培养液，用吸管将细胞奏乐开，然后经100目（孔径150 μm）和200目（孔径74 μm）不锈钢细胞滤网依次过滤（在培养皿中进行）200目网上细胞团主要为腺上皮细胞将滤液（主要为间质细胞）经1 000 r/min离心7 min，用适量FD培养液悬浮细胞制作3.0%和1.5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）梯度，将间质细胞悬液展于梯度层上，室温沉降20～30 min弃往上层BSA液，用FD培养液洗涤1遍（1 000 r/min离心7 min），将细胞按5×105/ml的密度接种于含10%胎牛血清的FD培养液中，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养用FD培养液冲洗200目滤网上的细胞（主要为腺上皮细胞），收集冲洗液，700 r/min离心5 min，弃上清，用适量FD培养液悬浮。

将细胞悬液展于装有8 ml FD培养液的15 ml玻璃离心管中，重力沉降10 min，弃上清，反复操纵4次，使腺上皮细胞团沉降至底层用含10%胎牛血清的FD培养液悬浮腺上皮细胞团后，接种于玻璃培养皿中，待混杂其中的间质细胞贴壁，3 h后吸出腺上皮细胞团，磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline, PBS）离心洗2遍（700 r/min离心7 min）用含0.02%依地酸（edetic acid, EDTA）的0.025%胰酶消化5 min，使腺上皮细胞团分散成单个细胞，然后吸进离心管，700 r/min离心7 min将细胞接种于含10%胎牛血清的FD培养液中，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养　　1.3 观察指标和方法　　1.3.1 细胞类型鉴定 细胞角蛋白（cytokeratin）广泛存在于人类上皮组织及培养的上皮细胞内，而波形蛋白（vimentin）则主要位于间质细胞中［5］所以分别选择鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体作为第一抗体，以SP染色法进行染色，对分离获得的子宫内膜两种细胞进行鉴定　　1.3.2 光学显微镜观察 将无菌盖玻片放进六孔培养板中，消化分离后的间质细胞接种于六孔培养板盖玻片上，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养。

从培养皿中取出间质细胞生长良好的载玻片，用PBS液洗往原培养液消化分离后的腺上皮细胞予以常规涂片间质细胞和腺上皮细胞用95%乙醇固定，常规HE染色，光学显微镜下观察　　1.3.3 细胞超微结构观察 将消化分离的正常对照子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞，EM在位和异位间质细胞及腺上皮细胞分别用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定，618环氧树脂包埋，LKBⅤ型超薄切片机切片，醋酸铀、枸橼酸铅双重染色，在ECNAI12型透视电镜下进行观察并摄像　　2 结果　　2.1 原代细胞分离培养情况 分离。