核酸类药物生产工艺.ppt

核酸类药物核酸类药物 基基 本本 概概 况况核苷酸生产工艺核苷酸生产工艺三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺9/16/20241生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 概概 述述 核酸类药物分为两类：核酸类药物分为两类：一类为具有天然结构的核酸类物质一类为具有天然结构的核酸类物质, , 这类药这类药物已广泛用于放射病物已广泛用于放射病(Co60)(Co60)、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有炎、心血管疾病等，属于这一类的核酸类药物有ATPATP、辅酶、辅酶A A、脱氧、脱氧核苷酸等核苷酸等第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合第二类为天然结构碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚合物物，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是，这类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿产生干扰素、免疫抑制的临床药物，主要有三氟胸苷、叠氮胸苷、阿糖腺苷等。

糖腺苷等 反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然反义核酸技术及反义药物：反义技术是用人工合成的或生物中自然存在的寡聚核苷酸片断（反义存在的寡聚核苷酸片断（反义DNADNA和反义和反义RNARNA），结合目标基因或），结合目标基因或mRNAmRNA特定序列特定序列( (靶核酸靶核酸) )，从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译从而有效地抑制或封闭基因的转录与翻译 反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递即干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递 9/16/20242生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 概概 述述 核核酸酸是是由由许许多多核核苷苷酸酸以以3 3’’，，5 5’’- -磷磷酸酸二二酯酯键键连连接接而而成成的的大大分分子子化化合合物物核核苷苷酸酸由由碱碱基基、、戊戊糖糖和和磷磷酸酸三三部部分分组组成成，，碱碱基基和和戊戊糖糖组组成成的的单单元元叫叫核核苷苷核核酸酸类类药药物物包包括括核核酸酸、、核核苷苷酸酸、、核核苷苷、、碱碱基基及其衍生物。

及其衍生物 依据化学结构和组成分四大类：依据化学结构和组成分四大类： 1 1 核酸碱基及其衍生物核酸碱基及其衍生物 2 2 核苷及其衍生物核苷及其衍生物 3 3 核苷酸及其衍生物核苷酸及其衍生物 4 4 多核苷酸多核苷酸 （（C C））（（U U））（（T T））腺嘌呤（腺嘌呤（A A））鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G））β-β-D-D-核糖核糖β-β-2-D-2-D-脱氧核糖脱氧核糖9/16/20243生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 核苷酸的制备核苷酸的制备 核核酸酸(RNA(RNA主主要要存存在在于于微微生生物物中中，，如如啤啤酒酒酵酵母母、、纸纸浆浆酵酵母母以以及及多多种种抗抗生生素素的的菌菌丝丝体体；；DNADNA主主要要存存在在于于动动物物内内脏脏等等) )经经酶酶、、酸酸、、碱碱水水解解生生成成核核苷苷酸酸，，然然后后分分离离提提取取制制备备各各种种核核苷苷酸酸的的方方法法通通称称水水解解核核酸酸法法。

用用催催化化剂剂的的不不同同，，分分为为酶酶水水解解、、酸酸水水解解和和碱碱水水解解等 (1)(1)酶水解酶水解 最常用的酶有桔青霉最常用的酶有桔青霉A.S3.2788A.S3.2788产生的产生的5’—5’—磷酸二酯酶，也磷酸二酯酶，也可用红酵母发酵所产生的可用红酵母发酵所产生的3’—3’—磷酸二酯酶磷酸二酯酶9/16/20244生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 核苷酸的制备核苷酸的制备 （（2 2）碱水解法）碱水解法 在在稀稀碱碱条条件件下下，，RNARNA容容易易水水解解得得到到2’—2’—核核苷苷酸酸和和3’—3’—核核苷苷酸酸实实际际上上这这是是由由于于稀稀碱碱水水解解过过程程中中，，先先形形成成一一个个中中间间环环状状物物2’2’，，3’3’环环状状核核苷苷酸酸，，它它很很不不稳稳定定，，进进一一步水解生成步水解生成2’2’和和3’—3’—核苷酸 稀稀碱碱水水解解的的浓浓度度随随温温度度和和作作用用时时间间的的不不同同而而异异。

用用1M1M氢氢氧氧化化钾钾或或氢氢氧氧化化纳纳在在80℃80℃下下作作用用1h1h能能使使RNARNA水水解解成成单单核核苷苷酸酸；；用用0.3M0.3M氢氢氧氧化化钾钾或或氢氢氧氧化化纳纳在在37℃37℃下下作作用用，，要要16h16h9/16/20245生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需能三磷酸腺苷是体内广泛存在的辅酶，是体内组织细胞所需能量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需量的主要来源，蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成都需ATPATP参与ATPATP经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷经腺苷酸环化酶催化形成环磷酸腺苷( (cAMPcAMP) )，是细胞内的生，是细胞内的生物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的调节作用物活性物质，对细胞许多代谢过程有重要的调节作用 ATPATP为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促为蛋白质、糖原、卵磷脂、尿素等的合成提供能量，促使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病有较使肝细胞修复和再生，增强肝细胞代谢活性，对治疗肝病有较大针对性。

但外源性大针对性但外源性ATPATP不易进入细胞，且与体内需要的量比较，不易进入细胞，且与体内需要的量比较，可能提供的量微不足道可能提供的量微不足道9/16/20246生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 白色类白色粉末，易溶于水，白色类白色粉末，易溶于水，难溶于有机溶剂在水中的难溶于有机溶剂在水中的溶解度具有氢型＞钠盐＞钡溶解度具有氢型＞钠盐＞钡盐＞汞盐的顺序在碱性溶盐＞汞盐的顺序在碱性溶液液(pHl0)(pHl0)及低温下比较稳定及低温下比较稳定 ATPATP二钠是两性化合物能与二钠是两性化合物能与可溶性汞盐和钡盐形成不溶可溶性汞盐和钡盐形成不溶于水的沉淀物，利用这种性于水的沉淀物，利用这种性质可分离质可分离ATPATP 1、化学结构和性质、化学结构和性质9/16/20247生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 （（1 1）工艺路线）工艺路线 2、以兔肌肉为原料、以兔肌肉为原料强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂 9/16/20248生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 ① ①兔肉松的制备兔肉松的制备 ② ②提取提取 取取肉肉松松加加入入4 4倍倍量量冷冷蒸蒸馏馏水水，，搅搅拌拌提提取取30min30min，，过过滤滤后后再再提提取取1 1次次。

合合并并2 2次次滤液，冷处静置滤液，冷处静置3h3h，经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液经布氏漏斗过滤至澄清，得提取液 2、以兔肌肉为原料、以兔肌肉为原料 ③③吸吸附附 取取处处理理好好的的氯氯型型离离子子交交换换树树脂脂装装入入层层析析柱柱，，用用pH3pH3的的水水将将柱柱平平衡衡提提取取液液上上柱柱流流速速控控制制在在0.60.6一一1ml1ml／／(cm(cm2 2.min).min)左左右右，，吸吸附附ATPATP上上柱柱过过程程中用中用DEAE—CDEAE—C薄板检查薄板检查 ④④洗洗脱脱饱饱和和ATPATP柱柱，，用用pH3pH3、、0.03M0.03M氯氯化化钠钠液液洗洗涤涤柱柱上上滞滞留留的的AMPAMP、、ADPADP及及无无机机盐盐等等，，流流速速控控制制在在1mL1mL／／(cm(cm2 2.min).min)再再用用pH3.8pH3.8、、1M1M氯氯化化钠钠液液洗洗脱脱ATPATP，，流流速速控控制制在在0.3ml/(cm0.3ml/(cm2 2.min).min)，，收收集集洗洗脱脱液液操操作作温温度度在在0 0一一10℃10℃9/16/20249生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 ⑤ ⑤除热原、杂质除热原、杂质 将洗脱液按总体积计加入将洗脱液按总体积计加入0.60.6％的硅藻土，％的硅藻土，0.40.4％的％的活性炭搅拌活性炭搅拌10min10min，用，用4 4号垂熔漏斗过滤，收集号垂熔漏斗过滤，收集ATPATP滤液。

滤液 ⑥⑥结结晶晶、、干干燥燥 用用6M6M盐盐酸酸调调滤滤液液至至pH2.5—3pH2.5—3，，在在28℃28℃的的水水浴浴中中恒恒温温, ,加加乙乙醇醇，，不不断断搅搅拌拌，，使使ATPATP二二钠钠结结晶晶，，用用4 4号号垂垂熔熔漏漏斗斗过过滤滤，，分分别别用用无无水水乙乙醇醇、、乙乙醚醚洗洗涤涤，，收收集集ATPATP二二钠钠结结晶晶，，置置五五氧氧化化二二磷磷干干燥燥器器内内真真空空干干燥燥，，即即得得ATPATP成成品品次次滤滤液液，，冷冷处处静静置置3h3h，，经经布布氏氏漏漏斗斗过过滤滤至澄清，得提取液至澄清，得提取液 2、以兔肌肉为原料、以兔肌肉为原料9/16/202410生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 3、产氨短杆菌直接发酵法、产氨短杆菌直接发酵法 9/16/202411生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 ① ①菌种培养菌种培养 培养基组成葡萄糖培养基组成葡萄糖1010％，硫酸镁％，硫酸镁1 1％，尿素％，尿素0.30.3％，玉米浆适量，％，玉米浆适量，磷酸氢二钾磷酸氢二钾1 1％，磷酸二氢钾％，磷酸二氢钾1 1％％pH7.2pH7.2，接种量，接种量7—97—9％，％，pHpH控制在控制在6.8—6.8—7.27.2。

② ②发酵培养发酵培养 培养温度培养温度30℃30℃，，36h36h，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨，，投入腺嘌呤，加尿素、氢氧化钠和氨，控制控制pHpH通风量1 1：：0.5v0.5v／／( (v·minv·min) ) ③ ③提取、精制提取、精制 发酵液加热使酶失活后，调节发酵液加热使酶失活后，调节pH3—3.5pH3—3.5，过滤，分离除去，过滤，分离除去菌体，上清液通过菌体，上清液通过769769活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用活性炭柱吸附，用氨醇溶液洗脱，洗脱液再用CL-CL-型阴离子交换树脂吸附型阴离子交换树脂吸附ATPATP，经氯化钠，经氯化钠——盐酸液洗脱．洗脱液经醇沉，盐酸液洗脱．洗脱液经醇沉，过滤，丙酮洗涤，脱水，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得过滤，丙酮洗涤，脱水，置五氧化二磷真空干燥器中干燥，得ATPATP品 3、产氨短杆菌直接发酵法、产氨短杆菌直接发酵法 9/16/202412生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物 三磷酸腺苷生产工艺三磷酸腺苷生产工艺 ① ①应用兔肌肉为原料的提取法生产应用兔肌肉为原料的提取法生产ATPATP，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白质，以，曾采用三氯乙酸沉淀蛋白质，以钡盐和汞盐纯化钡盐和汞盐纯化ATPATP。

此法耗用试剂多，成本高，易造成环境污染和直接此法耗用试剂多，成本高，易造成环境污染和直接危及操作人员身体健康后改用蒸馏水提取危及操作人员身体健康后改用蒸馏水提取ATPATP，树脂精制纯化，树脂精制纯化 从根本从根本上解决了上述存在的问题．又可回收上解决了上述存在的问题．又可回收AMPAMP、、ADPADP，兔肉渣还可食用，总，兔肉渣还可食用，总收率并不比汞盐法低收率并不比汞盐法低 ② ②产氨短杆菌产氨短杆菌B1B1是生物素缺陷型菌株，其诱变菌株也依赖生物素作为生是生物素缺陷型菌株，其诱变菌株也依赖生物素作为生长因子玉米浆中含有丰富的生物素，加入培养基中使长因子玉米浆中含有丰富的生物素，加入培养基中使ATPATP的产量显著提的产量显著提高 4 4、注解、注解 9/16/202413生物制药工艺学生物制药工艺学——核酸类药物核酸类药物。