第四章 基因的功能分析.ppt

第四章 基因的 功能分析主要内容v第一节 遗传图谱与连锁分析v第二节 基于作图的基因克隆v第三节 基因的突变分析v第四节 基因的表达分析基因的功能至少可以分为三个层次v基因水平的功能(如转录因子、RNA代谢、信号转导等)；v生物化学水平的功能(甲基转移酶、ATP酶、蛋白质降解等)；v生理学与生物学水平的功能(参与抗逆、控制花期、控制株高等)基因功能的表现v基因的功能可能会在所有三个层次都有表现，比如控制花 氰苷合成途径的转录因子，在基因水平它的功能是与启动 子结合，激活参与这个途径的基因的转录；在生物化学水 平，这些基因的转录造成了花氰苷的生物合成；在生理学 水平，这些代谢反应会影响到植物的抗病性、抗逆性和花 色等v也有些基因，其功能主要反应在某个层次，如普通转录因 子的某些亚基，它们的主要功能就是与特殊DNA序列识别 ，参与许多不同基因的转录在这种情况下，它的功能层 次应该定位在基因水平，它的突变所造成的生物学效应是 次生的、间接的v分子遗传学分为 “正向遗传学”和“逆向遗传学”，前者是通过表现型研究基因型，后者是通过基因型研究表现型正向遗传学v开始于一个突变株的表现型，然后通过遗传 学方法(杂交)分析这性状的分离组合比例， 最后把控制这个性状的基因克隆。

v在这一系统中，突变造成了基因功能的丧失( 在少数情况下是突变造成功能的获得)，所以 野生型性状被认为是这个基因的正常功能的 表现，即基因的功能在研究正式开始以前就 是已知的逆向遗传学v通过某种方法(如差异显示试验，酵母双杂交试验等)，研究者通过某种方法先得到了一个基因的克隆或一种蛋白质，但对它的具体功能尚不知晓，研究的目的就是要搞清楚这个基因的生物功能(即它所控制的生物学性状)正向遗传学的优点v突变表现型已知，只要这个性状是由单基因 或主效寡基因控制的，按部就班地往前走就 应该能够找到控制这个性状的基因v但是对多基因控制的性状，正向遗传学就颇 有束手无策的感觉v进入21世纪以来，通过正向遗传学手段已经 克隆了部分控制数量性状的基因正向遗传学的主要缺点v工作量大、耗费时间长据估计，要走完正向遗传学的全过程，一个研究人员要连续工作3～5年，如果是数量性状，这个时间长度可能还要加倍逆向遗传学的优缺点v快速准确：从基因到基因的突变到突变表现 型，可谓单刀直入、立竿见影v但是，由于很多基因控制的性状并不非常明 确，或者一个基因控制许多性状，或者这个 基因是必需的，突变株不能够成活，这些都 将使逆向遗传学研究陷入困境v 本章将沿着正向遗传学的研究方向介绍基因功能研究的方法与实例，并介绍功能基因组学的基本内容。

第一节 遗传图谱与连锁分析一、遗传图谱与物理图谱遗传图谱(genetic map)v又称为连锁图谱(linkage map)，是指遗传标记 (genetic markers)在染色体上的相对位置，或称“遗 传距离”v遗传距离用遗传标记在染色体交换过程中分离的频率 来表示，单位是cM (centimorgan，厘摩)相距1cM 的两个遗传标记在单染色体交叉(即姐妹染色单体发 生重组)中，具有1％相互分离的机会v遗传图谱对于分析基因组结构、遗传育种，以及与其 他生物的进化关系的研究都十分重要v构建遗传图谱的主要基础是拥有足够多的遗传标记遗传标记类型v主要分为4种，即形态学标记、细胞学标记、生物化学标记和DNA分子标记v前三种标记都是以表现型为基础的，而DNA分子标记则是在DNA水平遗传变异的直接反映，属于基因型标记v 分子标记是指染色体上可以识别的、可以监测其遗传情况的物理位置(如限制性内切核酸酶酶切位点、多态性片段、特异序列等)与表型标记相比，DNA分子标记具有以下优点：v①该标记可以在各发育时期的个体、组织、 器官甚至细胞水平作检测，既不受环境的影 响，也不受基因表达与否的限制；v②数量丰富；v③遗传稳定；v④对生物的影响表现“中性”；v⑤操作简便。

衡量遗传图谱质量高低的主要指标v有两个：一是广度，二是密度广度是 指标记覆盖整个基因组的程度，密度是 指标记物间的平均距离v一般来说，好的遗传图谱要覆盖广而且 分辨率高物理图谱v遗传图谱表示的是标记之间的相对距离，而DNA序列 上两点之间的绝对距离用物理图谱来表示v物理图谱是进行基因组DNA序列分析的基础，它的标 记都是分子标记，称为“序列标记位点 ”(sequencing tagged site，STS)物理图谱的距 离以碱基为单位v物理图谱包括限制酶切图谱(restriction map)、连 续片段图谱(contig map)和DNA序列图谱，其中DNA 序列图谱是物理图谱中最精细的图谱v 一般来说，遗传距离与物理距离大致呈正相关，也就是说，遗传距离越远的标记，其物理距离也越远但遗传距离并不能与物理距离完全等同I首先，在不同生物中，遗传距离和物理距离的相对 大小是不同的比如，在人类中，1 cM大约等于 1000kb，但在拟南芥中，1 cM相当于250 kb，在番 茄中相当于510 kb，而在玉米中相当于2140kbI其次，即使在同一生物中，遗传距离与物理距离的 关系也因标记物在不同性别的个体、在同一个体的 不同染色体、在同一染色体上的不同位置而异。

二、分子标记技术v分子标记特指两个亲本间DNA序列的差异之处，也就是所谓的多态性(polymorphism)在这里所说的分子标记主要就是指多态性v能够杂交的生物都是有一定的亲缘关系的亲缘关 系越远的生物，DNA序列间的多态性越多；亲缘关系越近的生物，DNA越相似，多态性越少DNA的多态性v一类是DNA序列中碱基构成发生了变化，以 单核苷酸多态性(SNP)最为普遍，如A→G、 C→T之类的变化；v另一类DNA多态性是DNA序列发生了插入或 剔除变化(insertion/deletion，InDel) InDel的长度变化极大，长的可达几十甚至上 百kb，短的仅有1 bp分子标记的检测技术v以分子杂交为基础的分子标记 (如限制性片段长度多态性，RFLP)； v以PCR检测技术为基础的分子标记以PCR技术为基础的分子标记v以PCR为基础的分子标记检测方法非常多，但可以把它们分成两类：单引物PCR标记和双引物PCR标记，后者还可以分成半特异引物PCR标记和全特异引物PCR标记两种1.限制性片段长度多态性v限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)是最早应用于作图的分子标记，它是限制性内 切核酸酶位点多态性，造成这种多态性的原 因可以是单碱基突变(SNP)，也可以是 InDel。

v RFLP技术有两个要点：一是限制性内切核酸酶的选择，二是探针的选择检测RFLP的主要步骤2．随机扩展多态性v随机扩展多态性(random amplified polymophismic DNA，RAPD)是单引物PCR标记技术，其原理是用长度为10个bp左右的随机序列DNA作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增v就某一特定引物而言，它能够与基因组中的反向重复序列形成互补双链，从而在它们之间的序列能够被扩增vRAPD检测的多态性主要是InDel，但也可能检测到碱基突变造成的多态性vRAPD技术非常简单方便，并且费用低廉主要缺点是重复性较差RAPD应注意问题vRAPD标记一般是显性遗传，这样对扩增产物的记录 就可记为“有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和 纯合子；vRAPD分析中存在的最大问题是重复性不高，因为在 PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变 ；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结 果的；v存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的 带后，并不能保证这些个体拥有同一条（同源）的 片段；同时在胶上看见的一条带也有可能包含了不 同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型（一般是 琼脂糖凝胶电泳）只能分开不同大小的片段，而不 能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。

SCAR(Sequence-characterized amplified regions)v基本步骤：先作RAPD分析，然后把目标RAPD片段 进行克隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设 计特定引物（一般比RAPD引物长，通常24个碱基） ，再进行PCR特异扩增，这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来这样的位点就称为 SCARvSCAR比RAPD和其它利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好，因为它有更高的可重复性（ 原因是使用的引物长），标记是共显性遗传的SCAR标记是目前分子标记在育种实践中能 直接应用的首选标记 3．扩展片段长度多态性v扩展片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)技术基本原理 是通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段，在高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶 上电泳，产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图AFLP技术步骤（一）模板DNA的制备v高分子量DNA的成功制备和避免部分降解是AFLP 成功的关键，在制备过程中要注意避免核酸酶 及各种失活物质的污染v待测DNA样品经过浓度和质量检测后，用6个碱 基识别位点和4个碱基识别位点的限制性内切酶 进行酶切，形成三种类型的酶切片段。

vDNA酶切完成后，经加热让限制性内切酶失活一）模板DNA的制备v酶切片段在连接酶的作用下与两种内切酶相 应的特定接头相连接，形成带接头的特异性 片段作为扩增反应的模板 vAFLP的接头是一种人工合成的双链DNA，长度 一般为14～18个核苷酸，由核心序列和内切 酶位点特异序列两部分组成由于EcoRI酶切可以产生小片段DNA便于 扩增，而MseI可以产生比较小而稳定的酶 切片段，因此，目前EcoRI接头和MseI接 头已广泛应用于AFLP多态性分析中二）DNA扩增反应 v酶切片段经过连续两次PCR扩增，通过两步扩 增使产生的扩增结果更清楚、重复性更好v首先以酶切后连接产物作为模板，用人工合成 的选择性单链寡核苷酸作为引物进行预扩增 预扩增的目的为了减少选择性碱基的错配，为 选择性扩增提供更多的模板，同时对模板起到 选择性纯化的作用，避免直接扩增造成的指纹 带型背景拖尾现象，从而使产生的指纹图谱更 清晰和具有更好的重复性 （二）DNA扩增反应v将预扩增产物稀释数倍再进行选择性扩 增反应v目前AFLP扩增中常用的引物为EcoRI引 物和MseI引物二）DNA扩增反应v选择性扩增反应的条件与常规的PCR主要的 不同之处是复性温度，其PCR开始于高温复 性（65℃），比常规PCR反应的复性温度高 10℃左右，以获得最佳选择性，以后复性温 度逐步降低，一直降到复性效果最好的温度 （56℃），然后在这个复性温度下，完成其 余的PCR循环周期。

三）聚丙烯酰胺凝胶电泳v AFLP反应中选择性扩增产物在5%～6%的变 性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，形成DNA 指纹，凝胶经干燥、即可进行结果分析 例：E37/M47引物组合在母本、父本、F1及F2单株的扩增结果M: Marker DL010; 母本. 父本. F1，1~10不育株；11~20可育株; 箭头示特异带E37/M47390. AFLP特点vAFLP的原理和其他分子标记方法相似，都是 寻找不同生物群体间基因组的多态性vAFLP要寻找的是限制性片段长度多态性 (RFLP)，然后通过PCR方法把这个多态性显 示出来所以，AFLP兼具RFLP重复性好和 PCR灵敏度高、特异性强的特点vAFLP属于半特异引物的PCR标记 4. 简单序列长度多态性v简单序列长度多态性(simple sequence length polymorphism，SSLP)利用短片段重复序列的变异当作标记 物，实际是利用小lnDel造成的多态性v比如，有一段三核苷酸ATG重复序列，该序列在Col-0中重 复15次[(A。