酶切位点保护碱基.doc

本本文文给给出出了了分分子子克克隆隆中中常常用用限限制制性性内内切切酶酶的的保保护护碱碱基基序序列列，，如如 AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI ，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI ，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI ，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为为什什么么要要添添加加保保护护碱碱基基？？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的 酶切位点，用于后续的酶切和连接反应由于直接暴露在末端的酶切位点不 容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR 引物时，人为的在酶 切位点序列的 5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶 切时的活性 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点 往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的 酶切位点切割 该该如如何何添添加加保保护护碱碱基基？？ 添加保护碱基时， 最最关关心心的的应应该该是是保保护护碱碱基基的的数数 目，而不是种类。

什么 样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm 值和各引物 的碱基分布及 GC 含量如果某条引物 Tm 值偏小，GC%较低，添加时多 加 G 或 C，反之亦反 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB 采 用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验实验结果 对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或 者当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行 实验方法：用 γ-[32P]ATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡核苷酸取 1µg 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20°C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时反应缓冲液含 70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mMDTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的 具体要求而定） 20%的 PAGE（7M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影 确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照若底物有较长的回文结构，切 割效率则可能因为出现发夹结构而降低切割率切割率% 酶酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列 2 hr20 hrAcc IGGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 0 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG0 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA>90 >90 >90>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA50 >90 >90>90 >90 >90BamH ICGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG10 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC0 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA0 0 500 0 >90BstE IIGGGT(A/T)ACCC010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG0 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG>90 >90 >90>90 >90 >90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA>90 >90 >90>90 >90 >90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG 0 0 0 0 CCCAAGCTTGGG1075Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG0 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG0 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG0 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC0 0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG0 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA0 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT10 >90>90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG0 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG0 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT0 10 >90 >90 00 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA0 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG1010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA0 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA0 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT10 7525 75Sma ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA0 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG10 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT0 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT>90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG0 >90 75 750 >90 >90 >90Xho ICCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG0 10 100 25 75Xma ICCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA0 25 50 >900 75 >90 >90。