兔椎间失稳软骨终板退变的实验研究.doc

1兔椎间失稳软骨终板退变的实验研究作者：张昭，霍洪军，杨学军，钟秀，邢文华【摘要】 ［目的］ 通过电镜研究软骨终板在椎间失稳环境下的退变过程，为椎间盘退变的治疗提供新的思路和方法 ［方法］ 取 48 只 6 个月龄日本大耳白兔，雌雄不限，体重为（2.5±0.2） kg，随机进行分组，分为对照组和实验组，对照组为 21 只；实验组为 27 只；先将实验组兔腰背部皮毛剪除，用安定注射液 1.25 mg/kg、氯胺酮 0.02 g/kg、阿托品 0.125 mg/kg 顺次耳缘静脉注射麻醉后，俯卧固定于手术台上，用 1%碘伏消毒手术区域，以髂嵴平对椎间隙（即 L6、7）为中心，从正中取一长约4 cm 纵行切口，切开皮肤及皮下组织，锐性分离，暴露棘突、椎板及上下关节突，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开，然后依次切除 L6、7 棘上及棘间韧带，咬除第 6 腰椎两侧下关节突，造成椎间失稳，用无菌生理盐水冲洗切口，依次缝合各层组织；术后动物在笼中自由活动实验组分别在术后 2 个月、4 个月、6 个月取材，对照组在相同条件下饲养后 2 个月、4 个月、6 个月取材；对椎间盘软骨终板用透射电镜观察软骨终板的结构，以综合判断软骨终板的退变过程。

［结果］椎间失稳可导致椎间软骨终板胶原纤维结构由整齐有序、排列紧密向杂乱无章、排列松散退变 ［结论］椎间失稳能明显导致椎间软骨终板的退变 【关键词】 椎间盘； 软骨终板； 椎间失稳； 退变Abstract: ［Objective］To find out the new method to cure the intervertebral discs degeneration by way of the eletron microscope study of the degeneration of the cartilage endplate in the circumstances of the intervertebral destabilization. ［Method］ To choose forty-eight white macrotia rabbits of Japan,which weighed within the range of 2.5±0.2 kg,female and male was unrestricted.These rabbits were divided into 2 groups randomly,with 21 rabbits in the contrast troup,with 27 rabbits in the 2experimental group.First 27 rabbits of the experimental group were destabilizated by operated on L6、7.Inj Diazepam 0.25 mg/kg,Inj Ketamine 0.02 g/kg and Inj Atropine 0.125 mg/kg was one by one injected into the rabbit through the auris vein,shearing the rabbit hair of backside waist,fixing the rabbit on operation table in face lying,using 1% Povidone Ioding to degerm the operation area.Every rabbit was incised at the backside of its waist,that incisal opening is located in the center of the intervertebral space (L6、7 space) that both side iliac crest line correspond ,from the meso-ordinate direction cut about 4 cm incision,cutting open skin and subcutaneous tissue,thoroughly ,exposing the spinous processes the vertebral plates and the upper-inferior articular processes,entirely segregating the muscles that cohere the spinous processes the vertebral plates and the articluar process,then excising the supraspinal ligaments and interspinal ligaments,biting off two sides the inferior articular processes of L6,in order that resulting in intervertebral destabilization,using 0.9% Inj.Sodium Chloride to washout the incisal opening,in order sewing up each layer tissues.After operation rabbits can freely move in the cages.To draw the materials from all groups after two months,four months and six months orderly.Using transmission electron microscope to observe the structure the cartilage endplate,the author should judge the degenerative course and mechanism of the cartilage endplate synthetically.［Result］The intervertebral destabilization can cause the collagen fibers degenerates from the regular and compact structure to the disorder and loose structure.［Conclusion］The intervertebral destabilization can distinctly lead to the degeneration of the cartilage endplate.Key words：intervertebral disc； cartilage endplate； the intervertebral destabilization; degeneration根据骨性关节炎的临床和实验研究，关节的稳定性在骨软骨退变及损害中发挥着非常重要的作用，因此，从理论上可以推测，椎间失稳软骨终板的退变过程，类似于关节失稳后关节软骨的退变过程。

认识软骨终板退变与椎间盘退变之间的相互关系及其发生机理是正确处理阻止和延缓椎间盘退变的关键本实验就单独一人为手术咬除兔 L6 腰椎两侧下关节突，改变腰椎内部结构造成椎间失稳，用电镜来观察椎间软骨终板的退变过程，着重考虑椎间失稳对软骨终板的退变影响1 材料与方法1.1 实验动物及分组3取 48 只 6 个月龄日本大耳白兔(由内蒙古农业大学动物实验中心提供),雌雄不限，体重为（2.5±0.2）kg，均在相同条件下饲养随机进行分组，分为对照组和实验组，对照组为 18+3 只兔；实验组为 24＋3 只兔（注：加号后的数为备用兔数，以下同）先将实验组 24+3 只日本大耳白兔,将其腰背部皮毛剪除，用安定注射液 1.25 mg/kg、氯胺酮 0.02 g/kg、阿托品 0.125 mg/kg 顺次耳缘静脉注射麻醉后,俯卧固定于手术台上,用 1%碘伏消毒手术区域，铺无菌手术巾，取髂嵴平对椎间隙（即L6、7）为中心（用 X 线机确定）,从正中取一常约 4 cm 纵行切口,切开皮肤及皮下组织,锐性分离,暴露棘突、椎板及上下关节突，将附着于棘突、椎板及小关节的肌肉全部分离开,然后依次切除 L6、7 棘上及棘间韧带,咬除 L6 椎体两侧下关节突，造成椎间失稳，用无菌生理盐水冲洗切口,依次缝合各层组织。

术后兔在笼中自由活动实验组分别在术后 2 个月、4 个月、6 个月取材，对照组在相同条件下饲养后2 个月、4 个月、6 个月取材对椎间盘软骨终板用透射电镜观察软骨终板的结构,以综合判断软骨终板的退变过程 1.2 试剂和设备1.2.1 试剂：①北京格林莱特商贸发展有限公司格林莱特产 四氧化锇（osmium tetroxide）；②海德创业（北京）生物科技有限公司醋酸双氧铀（uranyl acetate）；③上海易息科技有限公司提供 emicron 生产的 Epon 812 包埋剂组件1.2.2 设备：①日本产日立 H－700H 透射电子显微镜;②瑞典产 LKB- UltrotomeⅤ型超薄切片机;③博进:手提式 X 射线透视仪 BJI-1X 型;④手术器械一套1.3 观察指标及方法1.3.1 取材:将目标兔耳缘静脉注射 20 ml 空气栓塞处死,用骨刀快速切取完整4L6、7 椎间盘，取横截面为 1 mm×1 mm 左右包含软骨终板的组织放入 3%戊二醛固定液中固定, 24 h 后用 15%EDTA 溶液脱钙1.3.2 电镜超薄切片样本制备 脱钙后的技术流程为：将组织用自来水冲洗 12 h→2.5%戊二醛固定 24 h→0.2 mol/L 磷酸缓冲液漂洗 20 min（4℃冰箱内），共 3 次→（锇酸固定）1%四氧化锇固定 1 h→0.1 mol/L 磷酸缓冲液漂洗 20 min，共 3 次→（脱水）100%乙醇 15 min→（脱水）70%乙醇 15 min→（脱水）90%乙醇 15 min→（脱水）95%乙醇 15 min→（脱水）100%乙醇（Ⅰ）10 min→（脱水）100%乙醇（Ⅱ）10 min→包埋剂Ⅰ浸透（包埋剂与无水乙醇 1∶1 混合）30 min→包埋剂Ⅱ浸透（包埋剂与无水乙醇 2∶1 混合）30 min→纯包埋剂浸透 1 h→包埋→聚合：放在胶囊内渗透 24 h（37℃），60℃聚合 48 h→修块→超薄切片→醋酸双氧铀染色 30 min→电镜观察分析。

1.3.3 观察指标 用透射电子显微镜从形态学上观察软骨终板胶原纤维排列、分布，软骨终板软骨细胞形态学变化2 实验结果超微结构的变化：对照组在各实验时间点短期自然增龄过程中的软骨终板胶原纤维结构规整，排列有序紧密，软骨细胞的细胞核细胞膜清晰，细胞饱满，其变化无显著性差异（图 1～2）实验组在手术后各实验时间点的软骨终板胶原纤维逐渐由结构整齐紧密、排列有序逐渐向结构紊乱、排列无序而松散的方向发展，软骨细胞逐渐出现皱缩、胞浆致密、细胞器密集有不同程度的凋亡，整个软骨细胞的核染色质逐渐变致密近而变小固缩，其变化有显著性差异（图 3～8）3 讨论5椎间盘除纤维环外层外本身无血管结构，其营养供应主要有软骨终板途径和纤维环途径，其中前者是主要的软骨终板是位于椎间盘与椎体之间一层薄的透明软骨，它与椎体骨髓血窦直接接触，其营养物质转运主要通过血窦-软骨终板界面进行扩散(弥散) ［1］胎儿时期有自椎体穿过软骨终板的血管供应髓核，在 10 岁左右此血管通道大部分闭锁，其后髓核的代谢在一定程度上取决于软骨终板的通透性［2］临床观察以及实验研究均表明［3～。