实验五 培养基的制备与灭菌.docx

实验五 培养基的制备与灭菌一、目的要求1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法2. 掌握培养基的配置方法3. 掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的操作方法二、基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础由于微生物种类及代 谢类型的多样性．因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各 有差异但一般培养基的配制程序却大致相同．例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉 塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同 本实验配置牛肉膏蛋白胨培养基、配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0 g水 1000mlpH 7.4~7.6三、实验材料1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、lmol/LHCL、NaOH2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿等3. 其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等一）玻璃器皿的洗涤和包装1 ．玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂 的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。

移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用 自来水及蒸馏水冲洗洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用2）移液管的包扎：在移 液管的上端塞入一小 段棉花（勿用脱脂棉）， 它的作用是避免外界 及口中杂菌进入管内， 并防止菌液等吸入口 中塞入此小段棉花应 距管口约 0.5cm 左右， 棉花自身长度约 1〜1.5cm塞棉花时.可 用一外围拉直的曲别 针、将少许棉花塞入管口内棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为 准先将报纸裁成宽约 5cm 左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条 报纸的一端，约成45°C角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管 压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌二）培养基的配置1） 称量：一般可用 0.01g 天平称量配制培养基所需的各种药品，先按培养基配方计算出各 成分的用量．然后进行准确称量2） 溶解：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水）， 用玻璃棒搅动，加热溶解。

3） 定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积如某种药品用量太少时， 可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中4） 调pH： —般用pH试纸测定培养基的pH用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹 取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用 lmol/L NaoH或lmol/L HCl溶液进行调节调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液， 防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至 达到所需pH为止5） 过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基一般无特殊要求时，此步可省去注意事项：（1） 蛋白胨很容易吸湿、在称取时动作要迅速称药品是严防药品混杂2） 在琼脂熔化过程中，应控制火力，一目培养基因沸腾而溢出容器同时，需不断搅拌 以防琼脂糊底烧焦配置 培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免金属离子进入培养基， 影响细菌生长三） 培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱 脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。

1．试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相 接，橡皮管的中部加一弹簧夹分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插 入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入 试管内装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15X150 mm时， 液体培养基可分装至试管高度1／4 左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全 融化后，应趁热分装于试管中用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1 / 5（约3—4mI）， 半固体培养基分装量为管高的1／3为宜2 •三角瓶的分装用于振荡培养微生物时，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液体2培养基的若用于制作 平板培养基用时，可在250 m1三角瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉（按2% 计算），灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化四） 棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等1.试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞．然后直接压入试管或三角瓶口。

也可借 用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松， 塞好后以手提棉塞，试管不下落为准棉塞的2／3 在试管内，1／3 在试管外目前也有采 用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸用记号笔注 明培养基名称及配制日期，灭菌待用图 8-3 棉塞的制作图 8-4 正确与不正确的棉塞1.金属塞 2 正确 3、4 不正确2．三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上有时为了进行液体振荡培养加大通气量， 则可用8 层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮 纸并用线绳捆好，灭菌待用五）培养基的灭菌培养基经分装包扎后，应立即按配制方法规定的灭菌条件进行进行高压蒸汽灭菌 六）斜面和平板的制作1．斜面的制作斜面斜面长度不超过试管长度 l／2 为宜如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成2．平板的制作将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50°C左右倾入无菌培养皿 中。

温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50 C，培养基易于凝固而无法制作平板平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小 指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾 入 10~15mL 培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个 平皿中，冷凝后即成平板七）培养基的灭菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查最好取出1~2管（瓶），置于37C温箱中培养 1~2天，确定无菌后方可使用八）无菌水的制备在每个 250mL 的三角瓶内装 100mL 的蒸馏水并塞上棉塞或硅胶塞在每支试管内装 9mL蒸馏水，塞上棉塞或硅胶塞再在棉塞上包上一张牛皮纸，高压蒸汽灭菌O.IMPa灭 菌 20~30min五、实验报告补充：PDA培养基：葡萄糖20g、马铃薯200g、琼脂15g、水1000ml无琼脂即PDB培养基。